目的:环氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)又名前列腺素类过氧化物合成酶2,在组织损伤、炎症或细胞恶变时表达增加,表明COX-2可能与炎症、肿瘤等病理状态密切相关。大量研究表明,COX-2在肺癌,食管癌,胃癌,乳腺癌,结肠癌,肝癌中均有高表达,并对肿瘤耐药性、肿瘤预后具有重要意义。PGE2作为COX-2的产物,在刺激血管生长,抑制免疫功能,调节多种细胞增殖、肿瘤生长信号通路等方面均有重要作用。已有研究证实,COX-2的过表达能够通过削弱TGF-β的抗增殖作用进而促进细胞增殖,并促进抗凋亡蛋白Bcl-2以及抑制促凋亡蛋白Bax的表达进而抑制细胞凋亡。COX-2作为Bcl-2上游调控蛋白,还能够活化PI3K上调Mcl-1进而抑制肿瘤细胞凋亡。另有研究认为COX-2抑制肿瘤细胞凋亡是通过诱导p53基因突变导致的,或者COX-2介导Fas蛋白削弱凋亡信号,抑制COX-2能够上调凋亡蛋白caspase的表达。此外,COX-2能够降低E-cadherin的活性,促进细胞侵袭和转移。同时COX-2与MMP9蛋白的过表达具有相关性,抑制COX-2能够降低MMP家族的表达。研究还发现,COX-2产物PGE2能够上调肿瘤迁移重要蛋白、干性蛋白CD44的表达,并且抑制COX-2的表达同样能够抑制CD44的表达。在血管生成方面,COX-2诱导细胞产生VEGF和TGF-β,它们能够促进内皮细胞迁移及管状生成。敲低COX-2能够下调VEGF并显著抑制胃癌细胞生长。一些研究认为COX-2通过上调Akt蛋白,进而促进肿瘤血管生成。目前,COX-2抑制剂吲哚美辛、Celecoxib可明显抑制肿瘤生长和肿瘤血管生成,诱发肿瘤细胞凋亡,而且还能增强化疗药的细胞毒性和肿瘤的放射敏感性。然而以COX-2抑制剂为主的药物治疗往往容易产生较强的毒副作用,近年来,随着肿瘤分子生物学、肿瘤免疫学等学科的发展,使得针对肿瘤的基因诊断、靶向治疗、基因治疗逐渐成为可能,以COX-2为靶点,通过敲低或过表达某些转录因子从而达到抑制COX-2表达的目的已受到许多研究者的重视。目前,已发现COX-2转录因子NF-κB、AP-2、TFIIB,转录共活化子p300/CBP,使得COX-2靶向治疗进入深化阶段。由于基因转录调控的复杂多变性,COX-2还存在其他调控因子,本文的目的在于发现新的COX-2调控因子,研究其在COX-2转录调控中的作用机制,以及对肿瘤生长的意义。方法:(1)以肺癌细胞株为模板,运用新型启动子结合蛋白垂钓技术鉴定系统垂钓、鉴定和验证新的COX-2启动子结合蛋白。(2)应用基因转导和si RNA技术来特异性地激活或抑制COX-2启动子特异性结合蛋白的表达,通过体内、体外实验研究COX-2启动子结合蛋白调节肿瘤细胞的COX-2活性机制,以及对细胞增殖、迁移等生物学功能的影响。(3)应用RT-PCR、免疫印迹、免疫组化等技术检测人肿瘤细胞和正常细胞以及组织标本中COX-2启动子结合蛋白的表达水平,并结合细胞特性和临床资料分析COX-2结合蛋白的肿瘤特异性表达和它们在临床诊断、预测预后、复发和治疗靶点上的价值。(4)建立动物模型,验证Ku80对肿瘤生长以及对COX-2表达的影响。(5)应用免疫共沉淀技术检测Ku80与转录共活化子CBP相互作用,以及对COX-2表达的影响。结果:(1)通过生物素-链霉亲和素垂钓鉴定出COX-2启动子结合蛋白Ku80,并用Ch IP实验验证Ku80与COX-2启动子相互结合。(2)过表达或敲低Ku80能够增强或下调COX-2启动子活性及COX-2的表达。敲低Ku80能够抑制细胞增殖和迁移。(3)通过免疫印迹、免疫组化等技术,验证了COX-2与Ku80在肺癌细胞和组织中的表达相关性,以及Ku80对肿瘤预后、生存期具有重要意义。(4)体内实验证明,敲低Ku80能够抑制小鼠肿瘤生长及COX-2表达。(5)通过免疫共沉淀技术,发现Ku80能够与CBP相互结合,并通过乙酰化影响其对COX-2转录表达的控制。结论:本文通过生物素-链霉亲和素垂钓实验从肺癌细胞中成功垂钓并鉴定出COX-2启动子结合蛋白Ku80,并验证了Ku80对COX-2的表达调控。通过临床资料分析,表明Ku80与COX-2表达存在正相关,并且Ku80对肺癌转移、预后具有重要意义,为肺癌的治疗提供了一个潜在的靶点。