第1章引言心肌梗死(MI)是死亡的一个主要原因。心梗之后心肌纤维化在心脏修复方面是一个关键步骤,但是过度的纤维化会导致心脏的疾病,甚至死亡。因此,限制MI后的纤维化对于心脏疾病的预防和治疗很重要。心脏总细胞的大约60%-70%是心脏成纤维细胞(CFs)。正常情况下,CFs保持沉默,分泌胞外胶原来维持结构完整性和心脏的正常功能。MI后,CFs被激活扩增并转化为肌成纤维细胞,高表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),导致过量的胶原沉积在纤维化的心肌层。CF到肌成纤维细胞的转化(CMT)是MI之后心肌纤维化的初始步骤,以CMT为靶点可以为预防心肌纤维化提供新的希望。转化生长因子β1(TGF-β1)是MI后心脏修复和纤维化的一个关键调控因素。MI期间TGF-β1水平显著增加,而且它通过TGF-β1/Smad3信号通路促进了CMT,而通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路能够抑制CMT,并且改善MI后的心脏功能。Notch信号已经与各种疾病情况下的组织纤维化有关系,如硬皮病、肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化以及心脏纤维化。特别是,Notch信号在心脏修复中起着重要作用。心脏缺血后,Notch信号被激活以诱导血管生成改善血流供应,刺激CF扩增,减少心肌中活性氧的产生,抑制心脏细胞的凋亡,减轻缺血再灌注的损伤(IRI)。有趣的是,最近的研究报告了组织纤维化如肺纤维化和肾纤维化中的Notch信号和TGF-β1/Smad3之间的信号交互串联。然而,Notch信号是否可以与TGF-β1/Smad3信号进行交互串联以调节心肌纤维化仍不清楚。在这项研究中,我们的目的是研究心肌纤维化期间这两种重要信号通路的交互串联并确定心脏疾病的新治疗靶点。第2章Notch1与TGF-β1信号通路在心肌纤维化中的调控作用目的:构建用于Notch1胞内结构域(N1ICD)过表达或敲低表达的腺病毒载体,为探讨TGF-β1对大鼠CFs的影响是否会被Notch1信号拮抗。构建用于Smad3过表达或敲低表达的腺病毒载体,为探讨TGF-β1对大鼠CFs的影响是否由Smad3介导。方法:用TGF-β1处理大鼠CFs观察TGF-β1对成纤维细胞标记波形蛋白(Vimentin)、盘状结构域受体2(DDR2)、肌成纤维细胞标记物α-SMA和强力蛋白(Tensin)表达的影响。用Western blotting分析研究TGF-β1对大鼠CFs中Notch信号的影响。CCK8和Brd U实验测定TGF-β1处理对CFs扩增的影响。Transwell实验测定TGF-β1处理对CFs入侵的影响。TGF-β1处理以及N1ICD、Smad3过表达或者敲低表达是否对CFs的粘附能力和I型胶原蛋白的分泌有影响。结果:Western blotting分析结果表明,在大鼠CFs中TGF-β1减少了Notch1、N1ICD、DII1和DII4的表达。CCK8和Brd U实验显示,TGF-β1处理增加了CFs的扩增。在没有TGF-β1刺激的情况下敲低N1ICD增加了CFs的扩增,而过表达N1ICD显著降低了TGF-β1对CFs的影响。Transwell实验结果表明,TGF-β1处理增加了CFs的入侵。未经TGF-β1处理时敲低N1ICD的表达增强了CFs的入侵,而N1ICD的过表达抑制了由TGF-β1处理诱导的CFs的入侵。TGF-β1处理增加了CFs的粘附能力。在无TGF-β1处理的情况下,敲低N1ICD的表达加强了CFs的粘附力,而过表达N1ICD抑制了由TGF-β1处理诱导的CFs粘附力。同样,TGF-β1处理增加了CFs中I型胶原蛋白的分泌。在未经TGF-β1处理时,敲低N1ICD的表达增强了I型胶原蛋白的分泌,而过表达N1ICD抑制了由TGF-β1处理引起的I型胶原蛋白的分泌。如果不经TGF-β1处理,Smad3过表达或敲低表达并不影响CFs的生物行为。然而,敲低Smad3表达大幅减弱了TGF-β1诱导的扩增,入侵,粘附力和I型胶原蛋白的分泌。结论:TGF-β1促进CMT,并抑制大鼠CFs中Notch1信号;TGF-β1对大鼠CFs的影响与Notch1信号是相反的;TGF-β1对大鼠CFs的影响是由Smad3介导的。第3章Notch1阻碍TGF-β1/Smad3信号传导,抑制心肌纤维化目的:明确在CFs生物行为的管理过程中TGF-β1/Smad3和Notch1信号发生干扰,探讨大鼠CFs中TGF-β1/Smad3和Notch1信号的拮抗作用的分子机制。构建了α-SMA启动子-荧光素酶报告基因并对荧光素酶进行测定以更好地理解TGF-β1/Smad3和Notch1信号怎样拮抗调节CMT。方法:对CFs中N1ICD和Smad3进行免疫共沉淀实验,研究其相互作用。免疫荧光染色实验验证N1ICD和Smad3在CFs核内是否存在共定位。Western-blotting检测成纤维细胞标记物Vimentin、DDR2以及肌成纤维细胞标记物α-SMA和Tensin的蛋白表达受CFs中N1ICD和Smad3的过表达和敲低表达的影响。CCK-8和Brd U实验、Transwell实验、细胞入侵实验等检测N1ICD和Smad3的过表达和敲低表达对CFs的生物学行为:增殖、入侵、粘附和Ⅰ型胶原蛋白分泌的影响。荧光素酶检测N1ICD和Smad3的过表达和敲低表达对荧光素酶活性的影响。结果:不经TGF-β1处理,在CFs中就有内源性的Smad3磷酸化,并通过N1ICD表达的敲低得到增强。TGF-β1处理引起了Smad3磷酸化但这受到N1ICD过表达的拮抗。另一方面,如果未经TGF-β1处理的话,在CFs中存在内源性N1ICD的激活,但这受到Smad3过表达的拮抗。TGF-β1处理抑制了N1ICD在CFs中的激活,但这受到Smad3表达敲低的拮抗。免疫共沉淀实验表明N1ICD与Smad3相互作用,免疫荧光染色揭示N1ICD和Smad3在CFs核内的共定位。另外,N1ICD的过表达下调了成纤维细胞标记物Vimentin和DDR2的m RNA表达,但这被Smad3的过表达所拮抗。Vimentin和DDR2的m RNA表达被N1ICD下调,但这被Smad3表达敲低所拮抗。另一方面,肌成纤维细胞标记物α-SMA和Tensin的m RNA表达被N1ICD过表达下调,但这被Smad3过表达所拮抗。此外,α-SMA和Tensin的m RNA表达被N1ICD敲低上调,但这被Smad3敲低所拮抗。Western blotting分析显示成纤维细胞标记物和肌成纤维细胞标记物的蛋白表达的变化呈现相同的模式,在CFs中N1ICD过表达抑制了而N1ICD表达敲低促进了增殖、入侵、粘附和Ⅰ胶原蛋白的分泌,它们分别被Smad3过表达和Smad3敲低所拮抗。N1ICD过表达显著抑制了TGF-β1诱导的荧光素酶活性,抑制作用被Smad3过表达减弱。另一方面,敲低N1ICD表达可显著增强TGF-β1诱导的荧光素酶的活性,这被Smad3表达敲低所抑制。结论:大鼠CFs中TGF-β1/Smad3和Notch1信号的拮抗作用;TGF-β1/Smad3和Notch1信号相反地调节CFs的生物行为;TGF-β1/Smad3和Notch1信号拮抗性地调节α-SMA在CFs中的转录。第4章Notch1抑制TGF-β1/Smad3信号调控心肌纤维化作用的体内验证目的:探讨大鼠MI模型中TGF-β1/Smad3和Notch1信号对心肌纤维化的调节作用。方法:使用8周(Week,W)大雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠结扎冠状动脉左前降支(Left anterior descending coronary artery,LAD)方法建立大鼠MI模型,通过Western-blotting检测Smad3和N1ICD的过表达以及敲低表达对心脏病发作之后的心脏功能的恢复,CMT以及胶原蛋白合成的影响。结果:N1ICD的过表达显著改善心脏病发作之后的心脏功能的恢复,减弱CMT以及抑制胶原蛋白的合成。相比之下,N1ICD的表达敲低显著恶化了心脏病发作后的心脏功能损伤,增强CMT,以及增加胶原蛋白的合成。结论:TGF-β1/Smad3和Notch1信号在大鼠心肌梗死模型中拮抗性地调节心肌纤维化。