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氨氮的排放加剧了我国蛋白质资源紧缺和氮排放污染的现状。氨是哺乳动物体内氮营养素周转代谢的产物,可以在肝脏生成尿素(尿氮)排出体外,也可生成谷氨酰胺等被进一步利用。课题组前期研究结果表明,亮氨酸在肝脏的代谢率仅为4%~13%,并在氮素代谢调控中发挥重要功能。本研究旨在利用猪门静脉灌注技术,探究亮氨酸对不同来源氨在猪肝脏代谢的调控作用及机理:1、门静脉血氨(NH4+)是肝脏氨的主要来源,拟设置15NH4Cl组、亮氨酸+15NH4Cl组,研究亮氨酸对门静脉血氨的代谢调控作用;2、丙氨酸是氨的重要转运体,拟设置15N-丙氨酸组、亮氨酸+15N-丙氨酸组,研究亮氨酸对丙氨酸来源氨的代谢调控作用;3、混合氨基酸在肝脏的分解代谢产氨也是肝脏氨的主要组成部分,拟设置混合氨基酸组、亮氨酸+混合氨基酸组,研究亮氨酸对混合氨基酸来源氨的代谢调控作用。主要研究结果如下:(1)亮氨酸对门静脉血氨的代谢调控作用:与15NH4Cl灌注组相比,在灌注后的40~80 min,亮氨酸+15NH4Cl组降低了肝静脉血液中尿素氮(P<0.05)的水平,提高了肝静脉血液中15N-谷氨酸(P<0.05)和15N-谷氨酰胺(P<0.05)的水平。与15NH4Cl灌注组相比,亮氨酸+15NH4Cl组增加了肝组织中15N-谷氨酸(P<0.01)和15N-谷氨酰胺(P<0.01)的含量,提高了肝组织中谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GDH)的活性(约65%)及其基因表达水平(约1.8倍)(P<0.01)。结果表明:当NH4Cl提供肝脏氨源时,亮氨酸可通过提高肝脏GDH活性,减少尿素的产生,增加谷氨酸和谷氨酰胺的生成。(2)亮氨酸对丙氨酸来源氨的代谢调控作用:与15N-丙氨酸灌注组相比,在灌注后的40~80 min,亮氨酸+15N-丙氨酸组降低了肝静脉血中尿素氮(P<0.05)和葡萄糖(P<0.05)的水平;提高了肝静脉血液中15N-谷氨酸(P<0.05)和15N-谷氨酰胺(P<0.05)的水平。与15N-丙氨酸灌注组相比,亮氨酸+15N-丙氨酸组增加了肝组织中15N-谷氨酸(P<0.01)和15N-谷氨酰胺(P<0.01)的含量,提高了肝组织中GDH的活性(约50%)及其基因表达水平(约1.6倍)(P<0.01)。结果表明:当丙氨酸提供肝脏氨源时,亮氨酸不仅可以提高肝脏GDH活性,减少尿素的产生和增加谷氨酸和谷氨酰胺的生成,还可以降低猪肝脏葡萄糖的生成。(3)亮氨酸对混合氨基酸来源氨的代谢调控作用:与混合氨基酸灌注组相比,在灌注后的40~80 min,亮氨酸+混合氨基酸组降低了肝静脉血中尿素氮(P<0.05)和非必需氨基酸(Non-essential amino acids,NEAA)(P<0.05)的水平。与混合氨基酸灌注组相比,亮氨酸+混合氨基酸组降低了肝组织中NEAA的含量(P<0.05),提高了肝组织中GDH的活性(约45%)及其基因表达水平(约1.5倍)(P<0.01)。结果表明:当混合氨基酸提供肝脏氨源时,亮氨酸通过不仅可以提高肝脏GDH活性,减少尿素的产生,还降低了肝脏其他NEAA的含量。(4)亮氨酸调控GDH酶活的作用机理:以上研究表明,亮氨酸均可有效的提高猪肝脏GDH的酶活性(P<0.01),而SIRT4是GDH活性的抑制因子。进一步分析了添加亮氨酸后肝脏SIRT4的基因表达发现:在NH4Cl、丙氨酸、混合氨基酸作为氨源的条件下,SIRT4的m RNA丰度分别下调了约50%、41%、45%(P<0.01);SIRT4的蛋白表达量分别下调了约55%、51%、59%(P<0.01)。结果表明:亮氨酸可通过抑制线粒体SIRT4的表达,提高GDH的活性。本研究得到以下结论:1、门静脉NH4Cl作为氨源时,亮氨酸可减少肝脏尿素的产生,增加谷氨酰胺的生成;丙氨酸作为氨源时,亮氨酸不仅减少了肝脏尿素产生和增加了谷氨酰胺的生成,还可以降低肝脏葡萄糖生成;混合氨基酸作为氨源时,亮氨酸不仅减少了肝脏尿素的产生,还降低了肝脏NEAA的含量。2、亮氨酸减少肝脏尿素产生,增加谷氨酰胺生成的机理可能涉及到表观遗传学因子SIRT4的调控:亮氨酸通过抑制肝脏线粒体SIRT4的表达,提高GDH的酶活,促进更多的氨底物逃逸尿素循环,进入谷氨酰胺循环。本研究通过营养学与表观遗传学相结合研究了亮氨酸调控猪肝脏氨代谢的作用及机理,为养猪生产中节氮减排营养措施的制定提供了理论基础和实践指导。