论文部分内容阅读
经过长期的人工驯化和饲养,家蚕(Bombyx mori)已经成为一种具有重要经济价值的鳞翅目昆虫。蚕桑业作为我国传统优势产业,在世界上居于领先地位,但是蚕病在各蚕区均有发生,引起蚕茧减产。家蚕质型多角体病毒(B. mori Cytoplasmic Polyhedrosis Virus, BmCPV)是造成蚕茧减产的主要病原之一,常给养蚕业带来巨大的经济损失。目前对BmCPV感染的控制主要以综合预防等传统消毒方法为主,尚无有效的治疗措施,培育家蚕抗性品种是应对蚕病威胁的有效方法。本研究对家蚕经口添食BmCPV后0 h、3 h、24 h和72 h的脂肪体和中肠组织进行了高通量转录组测序,主要分析了影响BmCPV只侵染中肠的因子、家蚕抗性相关基因、BmCPV基因表达模式；进而对家蚕抗BmCPV的相关基因进行了初步鉴定；最后利用串联干涉病毒多个基因的方法制备对BmCPV具有潜在抗性的转基因家蚕品系。1.利用转录组测序分析家蚕和BmCPV的互作本研究利用大造3龄起蚕经口添食BmCPV,提取攻毒后0h、3h、24h和72h的中肠和脂肪体RNA,成功构建8个组织样品的24个cDNA文库,然后进行转录组测序,结果显示测序质量都比较好,24个文库的reads与家蚕基因组mapping率均超过95.3%。差异转录本变化数量统计结果显示,感染后脂肪体各时间点上调和下调的转录本数量多于中肠,在两个组织每个感染时间点都上调的转录本只有1个而下调的转录本为5个,分别有100、126和200个转录本只在中肠3 h、24 h和72 h上调表达。对差异转录本进行GO功能分析发现,感染BmCPV后抗氧化作用在脂肪体3h、24 h和72 h都上调,本研究筛选到了19个可能具有抗氧化功能的转录本,对应的基因分别为BGIBMGA007453、BGIBMGA008203、BGIBMGA009576、BGIBMGA014087和BGIBMGA000903;生物信息学分析显示6个具有跨膜转运功能的中肠特异基因被BmCPV诱导上调,包括基因BGIBMGA001299、 BGIBMGA014248、BGIBMGA014434、BGIBMGA004804、BGIBMGA009201和BGIBMGA012068。一些中肠特异基因可能参与对BmCPV的免疫防御,包括基因BGIBMGA008167、BGIBMGA009461、BGIBMGA012452、BGIBMGA013275和BGIBMGA007987;序列比对结果显示基因BGIBMGA008167和BGIBMGA012452编码丝氨酸蛋白酶,BGIBMGA009461编码肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子1,BGIBMGA013275编码锌羧肽酶al, BGIBMGA007987编码肽聚糖识别蛋白S2。肌动蛋白(actin)被BmCPV诱导上调,并且在中肠维持高表达。本研究还发现中肠感染72 h后,病毒基因S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8和S10有表达而S9基本不表达,其中S1、S2、S3、S6和57的表达量很高。2. BmCPV抗性相关基因的初步鉴定RT-PCR结果显示5个抗氧化相关基因在中肠前部、中肠后部、脂肪体和丝腺均有表达；qPCR检测发现BGIBMGA007453和BGIBMGA008203在脂肪体中被BmCPV诱导,BGIBMGA014087在中肠和脂肪体中都被诱导,BGIBMGA 000903只在中肠被诱导。RT-PCR表明具有跨膜转运功能的相关基因BGIBMGA001299 BGIBMGA014434、BGIBMGA004804和BGIBMGA012068在整个中肠特异表达,BGIBMGA009201只在中肠后部表达；时期表达谱显示BGIBMGA001299在家蚕各时期均有表达,BGIBMGA014434只在卵4天不表达,BGIBMGA012068和BGIBMGA009201在家蚕幼虫期都有表达,而且BGIBMGA009201在各起蚕时期的表达量高于眠蚕的。qPCR结果表明,BGIBMGA001299、BGIBMGA014434、 BGIBMGA009201和BGIBMGA012068在中肠均被BmCPV诱导表达。对免疫相关的中肠特异基因进行RT-PCR检测,结果显示BGIBMGA008167、 BGIBMGA009461、BGIBMGA012452和BGIBMGA013275在整个中肠特异表达,基因BGIBMGA007987主要在中肠表达,在丝腺也有较低表达；qPCR检测发现BGIBMGA012452、BGIBMGA013275和BGIBMGA007987在中肠24 h和72 h被BmCPV诱导上调表达,BGIBMGA008167在中肠3h和24 h被诱导。对BmAPN家族成员进行qPCR检测,结果表明,BmAPN1、BmAPN4和BmAPN9在中肠3 h、24 h和72 h被BmCPV诱导上调表达,BmAPN6在中肠3h和24 h被诱导上调,而BmAPN7在中肠3h被诱导下调了。3.干涉BmCPV基因提高转基因家蚕的抗性RNAi是一种广泛使用的抗病毒方法,参考前人的研究,本研究成功构建了两个转基因干涉载体,一个为IE1P+Hr3介导BmCPV非结构蛋白编码基因S5、S8、S9和S10串联干涉的转基因载体(pb-IE1P-FJG),另一个为IE1P+Hr3介导病毒结构蛋白编码基因S1、S2、S4和非结构蛋白编码基因S5、S9串联干涉的转基因载体(pb-IE1P-CHH)。通过胚胎显微注射,成功制备出pb-IE1P-FJG的两个转基因品系FJG-1和FJG-2,以及pb-IE1P-CHH的两个转基因品系CHH-1和CHH-2。反向PCR结果显示4个转基因品系的外源片段都插入在家蚕的基因间区。抗性检测显示,当三龄起蚕以1×104个／头经口食下感染BmCPV以后,FJG-1、FJG-2、CHH-1、CHH-2和非转基因芙蓉的死亡率分别为46.84%、89.90%、64.70%、43.80%和83.36%。qPCR检测结果表明,感染BmCPV后96 h,非转基因芙蓉体内病毒基因S1、S2、S4、S5、S8和S10的相对表达量分别为0.0826、0.0135、0.0138、0.0136、0.1687和0.0117,而转基因系统只有FJG-2检测到病毒基因S8和S10的表达。经济性状调查结果显示,转基因家蚕与非转基因家蚕之间的全茧量和茧层率没有明显区别。以上结果表明,干涉BmCPV基因可以提高家蚕抗性同时还不会影响其经济性状。