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利钠肽受体C(natriuretic peptide receptor C, NPR-C),作为利钠肽(Natriuretic peptides，NPs)家族受体中的第三成员，一种非鸟苷酸环化酶偶联受体，能够参与各种利钠肽及具有同源结构的多肽类化合物高度结合，调节其生物功能，且NPR-C能减短心房利钠肽(atrial natriuretic peptide，ANP)的半衰期。本研究旨在研究主动免疫重组绵羊NPR-C胞外区对阿勒泰羊血液生理生化指标及尾部脂肪组织基因表达的影响，为寻找调控畜禽脂肪沉积安全高效的新途径提供参考。本研究根据大肠杆菌(Eschericha coli)对密码子的偏爱性对绵羊NPR-C胞外区进行密码子优化，通过全基因合成技术合成NPR-C胞外编码区，利用基因工程技术构建大肠杆菌表达载体pET28a(+)-NPR-C。经IPTG诱导后NPR-C胞外编码区在E.coliBL21(DE3)中获得表达，表达的重组NPR-C胞外编码区经Ni-NTA纯化用于制备抗原。试验选取16只2月龄左右体重13.95±2.38kg雌性阿勒泰羔羊随机分为试验组和对照组，试验组(n=8)于绵羊颈部皮下免疫重组NPR-C200μg/只(重组NPR-C与佐剂比例为1:1，总体积900μL/只)，对照组免疫生理盐水与佐剂混合物900μL/只。2周后加强一次免疫(试验组100μg/只，总体积450μL/只，对照组450μL/只)。分别于免疫前、免疫后第15、30、90和180d空腹静脉采血5~8mL于肝素钠和EDTA(含抑肽酶)采血管中，分离血浆用于测定抗体和血液生理生化指标；手术摘取尾部脂肪组织，脂肪组织用于转录组测序。测序数据经差异表达基因筛选、GO、PATHWAY分析解析主动免疫重组NPR-C对阿勒泰羊尾脂组织基因表达的影响。
结果表明：重组NPR-C胞外区分子量约为50.55KDa，IPTG最佳诱导表达时间为4h，目的蛋白质占泳道总蛋白质的24.58%，纯化后的重组蛋白质浓度为0.46mg/mL。主动免疫重组NPR-C胞外区第15d时阿勒泰羊体内可检测到高水平的特异性抗体，加强免疫后，抗体水平进一步提高并维持至试验结束。主动免疫重组NPR-C胞外区对阿勒泰羊采食量、体重、血液中葡萄糖，低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和游离脂肪酸含量均无显著影响(P＞0.05)，但可显著提高血浆中甘油含量并显著降低血浆中甘油三酯含量(P＜0.01)。通过对激素水平的分析发现，主动免疫NPR-C胞外区可显著升高血液中脂联素(P＜0.01)、cGMP(P＜0.01)和胰岛素水平(P＜0.05)，ANP有升高的趋势(P=0.068)，但对脂肪酸合成酶活性和瘦素水平无显著影响(P＞0.05)。RNA-seq显示，在免疫重组NPR-C胞外区后第15、30、90和180d，阿勒泰羊尾部脂肪组织中分别有1809、599、309和423个基因上调，以及2083、505、438和456个基因下调。以|log2(FoldChange)|≥0.58，且pvalue＜0.05为阈值筛选脂肪代谢相关的差异基因，发现主动免疫NPR-C胞外区第15d时PDE3、PDE5、RGS5、ADCY7、STK4、ABCA1、和PDE3B8基因显著上调，AMPK和ATF4基因显著下调，第30d时GSTK1、INSIG1和MOGAT2基因显著上调，在第90d和第180d时未发现与脂质代谢相关的差异基因。在免疫后第15d，通过KEEG富集分析发现cGMP-PKG、脂肪细胞脂解的调节、胰岛素信号途径等通路显著上调，非酒精新脂肪肝和氧化磷酸化等通路显著下调；GO富集分析发现GTP酶活性的调节、脂肪细胞分化的正向调节以及GTP酶激活剂活性等生物过程显著上调，而细胞色素C释放、NADH脱氢酶活性以及电子载体活性等生物学过程显著下调；在第30d时，非酒精性脂肪肝、脂肪酸代谢、甘油酯代谢和氧化磷酸化通路显著上调；第90dcAMP信号通路显著下调，脂肪酸β氧化上调；第180d甘油三酯代谢过程和脂质转运体活性等生物学过程显著上调。以上研究表明，主动免疫NPR-C胞外区通过调节cGMP、cAMP和胰岛素信号途径以及氧化磷酸化过程促进绵羊尾脂组织脂解。
结果表明：重组NPR-C胞外区分子量约为50.55KDa，IPTG最佳诱导表达时间为4h，目的蛋白质占泳道总蛋白质的24.58%，纯化后的重组蛋白质浓度为0.46mg/mL。主动免疫重组NPR-C胞外区第15d时阿勒泰羊体内可检测到高水平的特异性抗体，加强免疫后，抗体水平进一步提高并维持至试验结束。主动免疫重组NPR-C胞外区对阿勒泰羊采食量、体重、血液中葡萄糖，低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和游离脂肪酸含量均无显著影响(P＞0.05)，但可显著提高血浆中甘油含量并显著降低血浆中甘油三酯含量(P＜0.01)。通过对激素水平的分析发现，主动免疫NPR-C胞外区可显著升高血液中脂联素(P＜0.01)、cGMP(P＜0.01)和胰岛素水平(P＜0.05)，ANP有升高的趋势(P=0.068)，但对脂肪酸合成酶活性和瘦素水平无显著影响(P＞0.05)。RNA-seq显示，在免疫重组NPR-C胞外区后第15、30、90和180d，阿勒泰羊尾部脂肪组织中分别有1809、599、309和423个基因上调，以及2083、505、438和456个基因下调。以|log2(FoldChange)|≥0.58，且pvalue＜0.05为阈值筛选脂肪代谢相关的差异基因，发现主动免疫NPR-C胞外区第15d时PDE3、PDE5、RGS5、ADCY7、STK4、ABCA1、和PDE3B8基因显著上调，AMPK和ATF4基因显著下调，第30d时GSTK1、INSIG1和MOGAT2基因显著上调，在第90d和第180d时未发现与脂质代谢相关的差异基因。在免疫后第15d，通过KEEG富集分析发现cGMP-PKG、脂肪细胞脂解的调节、胰岛素信号途径等通路显著上调，非酒精新脂肪肝和氧化磷酸化等通路显著下调；GO富集分析发现GTP酶活性的调节、脂肪细胞分化的正向调节以及GTP酶激活剂活性等生物过程显著上调，而细胞色素C释放、NADH脱氢酶活性以及电子载体活性等生物学过程显著下调；在第30d时，非酒精性脂肪肝、脂肪酸代谢、甘油酯代谢和氧化磷酸化通路显著上调；第90dcAMP信号通路显著下调，脂肪酸β氧化上调；第180d甘油三酯代谢过程和脂质转运体活性等生物学过程显著上调。以上研究表明，主动免疫NPR-C胞外区通过调节cGMP、cAMP和胰岛素信号途径以及氧化磷酸化过程促进绵羊尾脂组织脂解。