研究背景子宫内膜癌（endometrial cancer,EC）是世界范围内最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一,其死亡率在常见妇科恶性肿瘤中位列第三位,仅次于卵巢癌和宫颈癌,也是美国和欧洲最常见的盆腔恶性肿瘤。随着生活方式的改变,EC的发病率呈逐年上升且年轻化的趋势,严重威胁女性健康。其治疗以手术为主,辅以内分泌治疗、化疗、放疗和免疫靶向治疗等。临床上主要将EC分为两型:Ⅰ型为雌激素依赖型,病理类型以子宫内膜样腺癌为主,占EC患者的80%;Ⅱ型为非雌激素依赖型,病理类型包括透明细胞癌、浆液性癌和癌肉瘤等,本研究主要聚焦在子宫内膜样腺癌,后简称EC。雌激素是EC发生的高危因素,研究表明EC通常发生于肥胖或患有高血压及糖尿病等合并代谢相关疾病的女性,发病率随着肥胖率的增加而升高,体重指数（body mass index,BMI）每增加5个单位,患EC的风险就会增加50%以上。子宫内膜的恶性转化启动肿瘤细胞代谢重编程,该过程是其适应肿瘤微环境以维持恶性增殖表型的关键过程,也是肿瘤发生的关键因素。代谢紊乱包括无氧条件下的糖酵解增强、脂质从头合成途径的激活、细胞能量供给途径的转化等,皆与EC患者的预后息息相关。近年来,新的治疗靶点及新的免疫疗法在延长EC患者生存期方面显示出鼓舞人心的效果,然而EC的发病率和死亡率仍居高不下。因此,靶向肿瘤细胞的代谢改变以缓解并治疗代谢相关子宫内膜癌的研究意义重大。脂质代谢紊乱作为肿瘤的标志性特征之一,受到越来越多研究者的重视。甘油磷脂（Glycerophospholipids,GPLs）是含有磷酸的脂类,包括磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰甘油（PG）、二磷脂酰甘油、溶血磷脂、血小板活化因子等。甘油磷脂构成生物膜系统的基本骨架。不仅如此,甘油磷脂代谢还参与细胞的能量代谢和信号转导,是维持机体内稳态的重要途径之一。在营养缺乏的条件下,甘油磷脂合成的增强为细胞的快速增殖提供充足的膜成分和能量来源。多种溶血磷脂作为信号分子参与肿瘤的分化、侵袭和迁移等病理过程。越来越多的证据表明调控甘油磷脂合成和重塑的相关基因参与多种癌症的发生发展,然而其在子宫内膜癌发病过程中的调控作用鲜有研究。肿瘤微环境是肿瘤发生与生长转移所处的内外环境,包括肿瘤细胞所在组织的结构、功能和代谢等组分。肿瘤微环境的主要组成部分不仅包括肿瘤细胞,还包含免疫细胞、间充质细胞、细胞外基质（ECM）分子和炎症介质等,这些组成成分间的相互作用对肿瘤的发展和疾病的临床结局具有重要影响。研究表明通过免疫评分和基质评分计算得到的肿瘤纯度与EC的临床特征及预后具有显著相关性。且免疫相关基因可以作为判断EC预后的指标。脂质代谢物是影响肿瘤微环境的重要因子,但是甘油磷脂代谢相关基因的表达能否影响EC肿瘤微环境和临床结果目前仍不明确。本课题通过生物信息学方法利用TCGA数据库筛选出了影响EC预后和EC肿瘤微环境的GPLs相关代谢基因LPCAT1。LPCAT1,即溶血卵磷脂酰基转移酶1,是具有酰基转移酶活性的磷脂合成酶。大量研究表明LPCAT1在乳腺癌、肺癌、胶质母细胞瘤等多种恶性肿瘤中高表达,并通过调节细胞内磷脂组分发挥致癌作用,促进肿瘤的增殖、侵袭和转移,但LPCAT1在子宫内膜癌中的作用和机制尚不清楚。为了探索LPCAT1在子宫内膜癌中的致病作用,我们利用生物信息学分析方法及相关分子生物学实验,证实了 LPCAT1在子宫内膜癌中的促癌作用并探索了相关调控机制,这些研究结果为LPCAT1在未来成为子宫内膜癌临床早期诊断的分子标志物和精准治疗的免疫靶点提供了依据和可能。研究目的1.通过生物信息学分析技术在TCGA数据库中筛选显著影响EC肿瘤微环境及EC预后的甘油磷脂代谢相关基因。2.通过基础实验和多层次功能富集分析对筛选得到的甘油磷脂代谢相关基因LPCAT1进行功能学验证,探索其在子宫内膜癌中的促癌作用及机制。研究方法1.对TCGA数据库中子宫内膜癌转录组数据进行差异分析,通过单因素COX回归,LASSO回归,随机森立模型和PPI蛋白互作网络筛选对EC预后具有判断作用的关键甘油磷脂相关基因。2.利用ESTIMATE和ssGSEA分析识别影响EC肿瘤微环境的关键甘油磷脂相关基因。3.收集临床组织样本验证LPCAT1在EC患者的肿瘤组织和正常子宫内膜组织中的表达差异。4.采用小干扰技术和病毒转染技术构建敲减和过表达LPCAT1细胞系,通过EdU染色实验、MTT实验、流式细胞周期凋亡实验和克隆形成实验,探索敲减和过表达LPCAT1后对子宫内膜癌细胞生长和增殖的影响。5.通过Transwell实验和细胞成球实验,探索LPCAT1对子宫内膜癌细胞干性表型和侵袭迁移能力的影响,并通过Western blot实验检测相关分子的表达,证实LPCAT1对子宫内膜癌细胞干性表型和迁移侵袭能力的影响作用。6.利用Western blot实验检测TGF-β-Smad信号通路中关键分子的表达,探究LPCAT1影响子宫内膜癌细胞干性转化和侵袭迁移表型的内在调控机制。7.使用慢病毒稳转后的子宫内膜癌细胞构建异种移植瘤裸鼠模型,绘制瘤体生长曲线,测量瘤体大小并检测LPCAT1及TGF-β-Smad信号通路蛋白表达,探究LPCAT1在动物体内对子宫内膜癌细胞恶性表型和分子机制的影响。8.采用液相色谱质谱技术（LC-MS）检测过表达LPCAT1后,子宫内膜癌细胞中代谢物质含量的变化,进一步验证受 LPCAT1调控的关键脂质代谢物。研究结果1.从TCGA数据库中下载子宫内膜癌转录组数据进行差异分析,结果显示77个GPLs相关基因中有23个基因在子宫内膜癌中发生表达变化,并且其中11个基因与子宫内膜癌预后相关。通过LASSO模型、随机森林模型和PPI网络构建,最终筛选出4个在子宫内膜癌中发挥重要作用的关键基因:PLA2G2F,PLA2G2A,LPCAT2和LPCAT1。2.根据ESTIMATE算法用基因表达谱数据评估恶性肿瘤组织中的基质细胞和免疫细胞含量,计算免疫评分和基质评分,从而预测其含量,并计算每个肿瘤样本的肿瘤纯度。在筛选出的4个关键基因中,LPCAT1与子宫内膜癌肿瘤微环境关系最密切,LPCAT1高表达组的免疫评分和基质评分低、ESTIMATE评分低,提示肿瘤纯度较高。不仅如此,通过差异分析和相关性分析也发现LPCAT1的表达与15种免疫细胞的数量存在相关性。3.通过TCGA数据分析发现LPCAT1在子宫内膜癌组织中表达升高,LPCAT1高表达组较LPCAT1低表达组的总体生存期、无进展生存期和疾病相关生存期明显缩短。LPCAT1的表达在不同组织类型,即子宫内膜样癌和浆液性癌中存在差异;同时,LPCAT1的表达随病理分级的升高而增加。参考ROC曲线下面积,LPCAT1对子宫内膜癌具有较好的诊断作用。免疫组化结果进一步证实了 LPCAT1在子宫内膜样腺癌组织中高表达。4.体外MTT实验、克隆形成实验、EdU实验和流式细胞周期凋亡实验结果表明抑制LPCAT1的表达可以抑制子宫内膜癌细胞增殖,而过表达LPCAT1可以促进子宫内膜癌细胞增殖。Transwell小室实验证明抑制LPCAT1表达可以抑制子宫内膜癌细胞的侵袭迁移能力,过表达LPCAT1可以增强子宫内膜癌细胞的侵袭迁移能力western blot结果也证实过表达LPCAT1后,侵袭迁移相关分子ZO-1和Vimentin的表达明显升高。成球实验表明过表达LPCAT1使子宫内膜癌细胞成球能力明显增强,western blot结果也证实了干性相关转录因子Nanog、SOX2、OCT-3/4的蛋白表达量在过表达LPCAT1后明显升高。5.第二代RNA测序结果表明过表达LPCAT1后子宫内膜癌细胞内TGF-β信号通路被显著富集。同时Western blot实验也证实了过表达LPCAT1后TGFβ1和p-Smad的蛋白表达量显著升高。6.广谱脂质代谢组学筛选出45个差异显著的脂质代谢产物,其中下调的脂质代谢产物24个,上调的脂质代谢产物21个。显著上调的代谢产物主要是磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱,显著下调的主要是溶血磷脂酰胆碱和甘油三酯。通过KEGG分类分析显示,这些差异代谢物可能参与两种人的疾病通路:胰岛素抵抗和肿瘤中的胆碱代谢。研究结论1.LPCAT1在子宫内膜样腺癌组织中表达升高,具有良好的诊断和预后价值。2.LPCAT1的表达水平影响子宫内膜癌肿瘤微环境中的肿瘤细胞纯度和免疫细胞比例。3.LPCAT1明显提高子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;同时LPCAT1能增加子宫内膜癌细胞干性。4.LPCAT1通过激活子宫内膜癌细胞中的TGF-β-Smad信号通路发挥促癌作用。5.LPCAT1主要通过改变子宫内膜癌细胞内磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱的含量发挥促癌作用。创新性及局限性创新性:1.证实LPCAT1在子宫内膜癌中调控肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和干性。2.阐明了 LPCAT1对子宫内膜癌中肿瘤微环境的影响。3.体内外实验明确LPCAT1通过激活TGF-β-Smad信号通路促进子宫内膜癌发生发展。4.液相色谱质谱技术识别了 LPCAT1在子宫内膜癌细胞中主要调控的脂质代谢物。局限性:1.对LPCAT1影响子宫内膜癌肿瘤微环境及相关免疫细胞的具体机制缺乏实验验证。2.体内实验中未进行鼠尾静脉注射,未获取肺转移模型的数据。3.缺乏对LPCAT1调控的代谢物改变和TGF-β-Smad信号通路之间关系的研究,论证不够完整。