β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)是一种重要的工业应用酶。它同时具有寡糖水解和合成活性,既能水解寡糖生成相应的单糖,又能利用单糖合成寡糖。目前对于p-葡萄糖苷酶的研究方向主要集中在提高其水解活性上,而对其转糖基并合成二糖的活性研究相对较少。我们以里氏木霉中的β-葡萄糖苷酶Cel1b蛋白作为研究对象,希望通过理性改造提高其二糖合成活性以获得高效合成二糖的β-葡萄糖苷酶。我们首先通过同源模建模拟得到了Cel1b蛋白的三维结构,然后将Cel1b蛋白和纤维二糖进行柔性对接,结果显示纤维二糖的第二个葡萄糖残基处于一个相对亲水的环境(如N240)中,而其周围仍存在部分疏水性氨基酸残基如W173,1174,1177。我们据此提出了一个假说：β-葡萄糖苷酶的转糖基活性与其二糖结合部位氨基酸的亲疏水性有关,结合部位的疏水性的降低可能有助于提高其转糖基活性。我们进一步通过点突变技术对Cel1b蛋白进行了定点突变,将其活性中心的疏水性氨基酸变为了亲水性的氨基酸,获得了I177S, I177S/I174S、 I177S/I174S/W173H等三株活性中心亲水性逐渐增强的蛋白；并在原始蛋白基础上将亲水性氨基酸突变为疏水性氨基酸,获得了活性中心疏水性增强的蛋白N240I。我们通过对上述理性改造获得的四个突变体蛋白进行二糖合成与水解活性的鉴定,发现Cel1b蛋白及其突变体利用葡萄糖为底物可以合成昆布二糖、纤维二糖和槐糖三种二糖。当活性中心的亲水性增加时,其二糖合成活性增加,水解活性降低；当结合位点的疏水性增加时,其二糖合成活性消失,而水解活性保持不变。其中,1177S/1174S/W173H突变蛋白的槐糖最大产量达到了25 g/L。这一实验结果证实了我们上述Cel1b蛋白活性中心亲疏水性对二糖合成／水解活性影响的假说,并以此假说为出发点,通过理性改造获得了一株高效合成昆布二糖和槐糖的p-葡萄糖苷酶。这对以后p-葡萄糖苷酶的定向改造及其催化机制的研究具有重要指导意义。本文的创新性如下：1.第一次成功利用生物信息学手段对里氏木霉胞内的p-葡萄糖苷酶Cel1b蛋白进行结构分析,提出了影响其催化活性的假说,进而通过理性改造证明了这一理论的可行性。为以后对其他β-葡萄糖苷酶的理性改造提供了新的思路和方法。2.通过理性改造我们获得了一种能够生产高附加值的昆布二糖和槐糖的生物酶,这为昆布二糖和槐糖的工业化提供了可能,具有巨大的工业化前景。