背景:骨组织具有很强的再生修复能力,在良好的生物学微环境下,绝大多数骨损伤均能得到完全愈合[1]。过去十多年来,随着全球医疗卫生行业的飞速发展,骨损伤的治愈率得到极大的提高。然而,仍然有一些骨科疾病,如脊柱融合、大段骨缺损、骨肿瘤切除等等疾病的治愈率仍有待提高。制约上述等疾病治愈率的很大一部分原因是缺少合适的植骨材料[2]。在自体骨取骨量少、易出现并发症、增加手术风险等不利条件下,迫切需要开发一种安全,经济,有良好的组织相容性和成骨诱导性的组织工程骨。回顾历史,先后有大量组织工程生物材料问世并应用于临床。我们根据目前已问世的组织工程生物材料的特性及其要求,大体上可将其分为三代[3]。第一代组织工程生物材料为惰性生物材料,其基本要求是能填充组织缺损,对宿主无或仅有很小的毒性,且几乎不引发宿主免疫排斥反应。主要代表产品有,不锈钢、钴铬合金、钛和钛合金(1940s)、镍钛记忆合金(1960s)等金属及其合金材料,氧化铝、氧化锆和多孔陶瓷等陶瓷材料,硅胶、丙烯酸树脂、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)和聚甲基丙烯酸甲脂(又称有机玻璃,PMMA)[4]等高分子材料。第一代组织工程生物材料应用于临床已有半个多世纪的历史,至今仍占有一定临床市场。但是,它们所共同面临一个问题就是,移植后生物材料表面有多种非特异蛋白沉积,引起细胞非特异性反应,最终导致生物材料周围被纤维组织完全包裹,增加了翻修手术难度。为了克服第一代生物材料的不足,促使了第二代生物材料的问世。第二代组织工程生物材料包括生物活性和生物可降解性生物材料,该类生物材料在20世纪80年代开始逐渐问世,要求生物材料表面具有生物活性能促使材料和组织更好地整合,或材料在组织修复过程中能逐渐被降解吸收。主要代表产品有玻璃陶瓷、钙磷复合物等生物玻璃[5],金属和生物陶瓷或羟基磷灰石(HA)的复合物,聚乙二醇(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)等可吸收的高分子材料[6]。第三代组织工程生物材料综合了以往生物材料的生物活性和生物可吸收性的特点。且降解产物也具有生物活性,能在分子水平诱发细胞特异性反应,主要代表产品有PLA、PCL和HA等的高分子无机复合材料[3,7-9]。在60多年的历史长河中,伴随材料科学、工程学、物理学、化学、生理学和医学等学科的不断进步和相互合作,已有大量新型骨组织工程生物材料先后问世。其中在临床修复骨缺损的治疗中,得到广泛应用的骨生物材料主要是将羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite,HA)、三磷酸钙(TCP)、复合磷酸钙等无机物通过纳米技术与人工合成的可降解高分子材料,如聚乙二醇(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)等,相结合制成伺时具有生物活性和生物可降解性的无机复合材料。在材料制作过程中,通过最大限度模拟人类骨骼的构成成分,以达到仿生学的目的。然而,令人遗憾的是,尽管随着合成技术的不断改进,高分子无机复合材料的生物力学强度和骨诱导能力得到了较大提高。但是目前的高分子无机复合材料仍面临着一些共同问题:第一、可复合的无机材料有限,受高分子材料的化学结构限制,目前最多仅能复合30%-50%的无机成分,如临床应用较多的聚左旋乳酸羟基磷灰石(PLLA-HA),最多只能复合30%的HA[10],这与人类骨骼60%-65%的无机成分相差甚远;第二、体内降解较慢,且降解产物诱发局部无菌性炎症,导致继发性骨吸收[11];第三、骨整合性不足,生物材料不能很好的和周围骨组织完全整合,导致局部生物力学不稳,影响骨组织修复。为寻找出一种克服以上所述缺点的高分子复合材料,本实验设计了以柠檬酸和羟基磷灰石为主要原料的高分子复合材料POC-HA,观察用该材料制成的组织工程骨在体外和体内的特性,探究其在骨科领域是否有良好的发展前景。目的:通过合成基于POC-HA的组织工程骨,观察其超微结构的表面特性,观察其在生物体外的降解能力,观察其细胞生物相容性,并用于兔腰椎后外侧融合,探索POC-HA组织工程骨在活体内诱导成骨的效果,并与自体骨相对比其融合后承载应力水平,旨在为当前临床寻找一种安全、经济、可代替自体骨的新型组织人工骨提供新的视角。方法:将制备好的POC-HA组织工程骨经过清洗、固定、干燥,喷镀金属后用扫描电镜测试;用分离好的兔BMSC,制成高密度的细胞悬液滴于钴60灭菌后的POC-HA组织工程骨上,6小时后补足培养基持续培养48小时后,经固定、清洗、干燥、喷金后用扫描电镜观察材料表面细胞贴附情况;将制备好的POC-HA组织工程骨置于PBS溶液(PH7.4,37℃C),在相对稳定的环境下放置20周,观察其降解情况;将制备好的POC-HA组织工程骨条用于兔腰椎后外侧融合动物模型上,通过对饲养5周、10周、15周三个时间点的取材标本进行Micro-CT扫描,分析骨密度,骨体积/总体积等数值,判断其骨痂生长情况,取15周组织工程骨组与同样条件饲养15周的自体骨融合组进行对比;对所取的兔脊柱标本进行两端包埋,只允许融合区域受力,测试各组承载最大应力情况;将取材标本固定、脱钙、包埋、切片,然后进行组织染色,观察5周、10周、15周组织工程骨是否有细胞附着、能否诱导成骨及是否有新生骨及其滋养血管的产生。结果:1、基于POC-HA的组织工程骨的微观表面结构基于POC-HA的组织工程骨具多孔状微结构,空隙率为70%,孔径在微米级,平均直径为200-500微米,空隙连通性好,表面不光滑,有利于细胞伸出伪足附着。2、基于POC-HA的组织工程骨体外复合细胞的能力将复合兔骨髓间充质干细胞(BMSC)后的组织工程骨置于光学显微镜下,可以看到组织工程骨边缘有成簇的细胞团层叠在一起,细胞扁平状,细胞质均质、透亮,细胞的活力良好。经扫面电镜观察附着细胞的组织工程骨的超微结构,可以看到兔BMSC完全贴附于组织工程骨表面,成梭形扁平状,并伸出大量的伪足附着于材料的表面,细胞生长密集,并可以看到分裂相的细胞,这说明组织工程骨在体外复合细胞的能力很强,并且组织工程骨本身对细胞没有毒性作用,兔BMSC在其表面能够旺盛增殖,是一种生物相容性良好的材料。3、基于POC-HA组织工程骨的体外降解能力检测将置于稳定环境,固定PH的PBS溶液中的POC-HA组织工程骨,在2周、6周、12周和20周这四个时间点分别测试一次。称重前,样本均用去离子水漂洗,然后干燥,重量丢失量用最初重量Wo与时间点重量Wt的差值除以Wo后乘以100%来计算:Mass lose(%)=wo-wt/wo× 100%[12]。本实验所用POC-HA组织工程骨的HA含量为65%,在20周的时候重量丢失量大约为8.4%。基于POC-HA组织工程骨在自然条件下,可以自发稳定的降解,说明该材料本身具有降解能力,这为该组织工程骨进入动物体内实验创造了条件。4、Micro-CT对POC-HA组织工程骨应用于兔腰椎后外侧融合的效果评价Micro-CT扫描显示组织工程骨各组和自体骨移植组均形成骨桥连接。5周组织工程骨组新生骨痂很少,组织工程骨较规整,横突间没有形成骨性融合;10周组织工程骨组新生骨痂稍微增多,组织工程骨可见变得稀疏,有降解,同时骨痂形成包绕组织工程骨,形成较牢固的融合,但融合不完全不彻底;15周组织工程骨组新生骨痂最多,融合区域骨量较前两组明显增多,组织工程骨残留明显减少,横突间形成牢固而稳定的骨性融合;15周自体骨移植组显示移植的自体髂骨大部分被吸收重建,在横突之间新生骨痂形成密致的骨桥,形成牢固而稳定的骨性融合。Micro-CT对扫描样本进行三维重建后,对选定区域进行骨分析,得到骨密度和骨体积分数来评价新生骨产生量的多少。通过对比5周、10周、15周组织工程骨实验组,骨密度和骨体积分数呈上升趋势,通过统计学分析,三组之间骨密度和骨体积分数有显著性差异(P<0.05),结果说明随着时间的增长,新生骨骨量不断增加,组织工程骨在其中发挥了明显的骨传导性和骨诱导性作用;通过对比15周组织工程骨组与15周自体骨移植组,骨密度和骨体积分数经统计学分析,有显著性差异(P<0.05),结果说明在15周组织工程骨还未完全降解,尚有少许残余,还未形成完全的骨爬行替代。5、生物力学对POC-HA组织工程骨应用于兔腰椎后外侧融合的效果评价对所检测样本进行三点弯曲试验,根据弯曲载荷-变形曲线,测出融合区域所能承受的最大应力值。通过对比5周、10周、15周组织工程骨实验组最大应力对比,融合区域承载最大应力值呈上升趋势,通过统计学分析,三组之间融合区域承载最大应力有显著性差异(P<0.05),结果说明随着时间的增长,融合区域骨量增多,新生骨矿化更加完全,组织工程骨中富含的柠檬酸在促进骨矿化方面有显著作用;通过对15周组织工程骨组和15周自体骨移植组的融合区域承受最大应力进行统计学分析,没有显著性差异(P=0.064),结果说明组织工程骨自身的骨诱导性和可降解、多微孔结构特性有利于骨组织的爬行替代,在骨组织长入过程中,组织工程骨发生降解,微孔长满骨组织并与组织工程骨形成紧密的螯合,能承受与自体骨移植组相当的应力。6、组织学观察评价POC-HA组织工程骨生物体内的诱导成骨作用HE染色5周组织工程骨组可以看到组织工程骨上爬行有大量细胞,细胞分泌有大量细胞外基质,活力良好。与体外组织工程骨复合细胞试验相互印证,证明组织工程骨有良好的生物相容性;10周组织工程骨组可以看到细胞数目增多,有些细胞处于旺盛的细胞分裂相,证明组织工程骨有优秀的诱导细胞分裂的能力;15周组织工程骨组出现了大量的被伊红染成红色的成熟新生骨(New Bone)及滋养血管,新生骨的产生证明基于POC-HA组织工程骨具有很强的骨诱导性。Masson染色5周组织工程骨组可看到有细胞在组织工程骨上附着,有编织骨形成;10周组织工程骨组可以看到旺盛的细胞分裂相;15周组织工程骨组可看到染成深蓝色的新生骨组织形成,并与淡染的未完全降解的组织工程骨形成紧密的螯合。结论:本课题研究证明,基于POC-HA的组织工程骨具有微孔的结构,有着良好的细胞相容性与组织相容性,其自身在体外自然环境中有稳定的自降解能力,在体内骨组织中与细胞及体液环境的相互作用,能加速其降解;从应用于兔腰椎后外侧融合来看,其具有明显的骨传导性和骨诱导性,是一个有很好发展前景的骨移植替代材料。