随着社会经济的高速发展,人类的生存生活方式发生了很大的变化,但由此伴随的人类生殖健康方面的问题日趋严峻。由于环境污染、辐射、肥胖、高龄等社会心理因素所致的自身免疫系统紊乱、内分泌失调等生理生化变化致人类不孕不育难题日益突出,其中男性不孕因素占40-50%,主要包括梗阻性无精症、非梗阻性无精症、少弱精子症等异常。辅助生殖技术(ART)有效地解决了大部分不孕不育者的生育问题,对于有生育遗传异常胎儿风险的不孕不育夫妇,需要结合胚胎植入前遗传学诊断(PGD)或胚胎植入前遗传学筛查(PGS)技术行助孕治疗。此种卵裂期活检、囊胚期活检的方法极大地弥补了前期仅靠形态学对胚胎判断的缺憾,深入地对胎儿染色体情况进行检测,但其需要在显微操作系统中进行激光打孔,后用活检穿刺针分别吸取卵裂球、滋养外胚层细胞送检,这种操作是否影响细胞的全能性进而损伤胚胎的发育潜能,或者对子代的后天发育产生潜在损害?鉴于此种隐性损伤,引发我们对无创性胚胎植入前检测技术的不断探索。前期科学家成功地在母体血液循环中发现了起源于胎儿的游离DNA的存在。由此我们考虑在胚胎培养液中是否也存在遗传物质。在本次实验中我们采用快速煮沸的方法来获得废弃胚胎和其相应培养液中遗传物质;用聚合酶链反应通过扩增SRY基因来检测游离DNA。在培养胚胎第三天,第四天,第五天及第六天的培养液检测到了Y染色体上的SRY基因,在第一天及第二天的培养液中未检测到阳性信号。我们的研究证实,在培养过程中胚胎Y染色体的片段会释放到其相应培养液中。若此发现经过大批量样本证实的话,检测SRY基因则会是检验Y染色体连锁相关遗传性疾病的有效方法,并且其无创、简便的检测方式会是胚胎植入前诊断技术发展的新方向。严重少弱精患者中,其精子的畸形率很高,行ICSI后,可能产生畸形胚胎。因此,有必要对这类患者的胚胎也进行移植前无创诊断。但首先需要解决这部分患者稀少精子的保存问题。前人采用cell sleeper、cryotop containers、cryoloops、cryostrip和cryoleaf等方法,而我们在操作中发现了可能存在的交叉污染、复苏率低等问题,因此我们在其基础上进行了实用性、可操作性等改进,建立了cryopiece系统,即单精子冷冻技术,经过伦理委员会批准后于临床实施,获得了初步成效。在本文中我对少弱精患者的珍贵精子行基于冷冻薄片的低温冷冻保存技术后,进行胞浆内单精子注射,而后对其临床结局进行总结。本次实验收集了来自四位梗阻性无精症或者严重少弱精患者的126个精子行冷冻薄片冻存,在取卵当日解冻后获得了88个精子,可活动精子率是47.5%。之后选取30个精子分别与其配偶的30个处于减数分裂第二期的成熟卵子行卵胞浆内单精子注射术,其中22个受精,19个受精卵分裂,之后,得到11个胚胎。每个女性病人各移植2枚新鲜胚胎,最后总共有4个健康胎儿诞生。我们新颖的冷冻薄片系统由于其高活动精子获得率、高受精率和成功的妊娠结局,可以结合胞浆内单精子注射术在辅助生殖领域推广应用。我们用简便快捷的方法可以检测出胚胎培养液中DNA,那么微量DNA所能反应的胚胎染色体的具体精确程度仍有待于探索,我们在本次研究部分进一步采用了基于培养液的无创性染色体检测技术(NICS),它是根据目前最先进的全基因组基因扩增技术:多次退火环状循环扩增技术(MALBAC),其不同于以往的非线性或指数型扩增方法,MALBAC技术利用特殊引物,使得扩增子的结尾互补而成环,从而很大程度上防止了DNA的指数性扩增。其灵敏度高,需要的起始模板量由微克级可以降低到皮克级;扩增均匀性远远好于其他扩增技术;细胞拷贝数CNV分析与标准样品高度一致;且90%以上位点可被成功扩增。我们对来自11位病人的25枚胚胎及其相应的第三到第五天的培养液分析进行MALBAC技术的全基因检测,其中有8对是相匹配的,其检出率达到32%。研究中我们对两个克氏症病人的血液及所获得的精子行胞浆内单精子注射后的胚胎也进行了MALBAC技术全基因检测,根据此检测结果选择染色体正常胚胎行移植,其中一位病人成功妊娠。由于NICS的无创性、检测的快捷性,若得到大样本证实,将为胚胎植入前检测提供新型、便捷的检测方案。