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第一部分RIP1/3依赖的程序性坏死促使OVX大鼠骨细胞过度死亡目的:检测程序性坏死关键信号分子RIP1、RIP3在OVX大鼠骨质疏松症模型中骨组织的表达情况,并比较不同时期发生程序性坏死骨细胞数量的差异,以证实程序性坏死参与了骨质疏松症的发病过程并探讨其相关机制。方法:1.将健康成年雌性SD大鼠随机分为OVX(卵巢切除术,48只)和Sham(假手术,48只)两组,分别行卵巢切除术或假手术造模。并且将OVX和sham组大鼠分别按不同时间点随机分为0W、4W、8W、12W组(每组12只)。2.应用DXA测定股骨近端的骨密度,Micro-CT扫描Ward’s三角骨组织微结构变化。3.应用荧光定量PCR、western blot及免疫组化法测定TNF-α、RIP1、RIP3的表达情况,应用激光共聚焦观察RIP1和RIP3蛋白共表达情况,应用TUNEL+cleaved caspase-3荧光染色及透射电镜辨别骨细胞的死亡方式。结果:1.大鼠行ovx术后8w,股骨近端骨密度明显降低(p<0.05),ward’s三角骨组织tb.sp(trabecularseparation,骨小梁分离度)明显增高,而bv/tv(bonevolumefraction,骨体积分数)、tb.n(trabecularnumber,骨小梁数量)明显降低(p<0.05),到术后12w,股骨近端骨密度、bv/tv、tb.n进一步降低,同时tb.th(trabecularthickness,骨小梁分厚度)也明显降低(p<0.01),而ward’s三角骨组织tb.sp进一步增高。2.在ovx术后8w,电镜下发现具有典型坏死形态特征的骨细胞;激光共聚焦显示rip1和rip3蛋白于骨细胞胞浆呈明显共表达;但在术后0w,4w,12w均未发现发生明显坏死样变化的骨细胞和明显rip1和rip3蛋白的共表达。从术后4w开始,ovx大鼠tunel和cleavedcaspase-3阳性骨细胞百分率较sham组明显增多(p<0.05);在术后8w,tunel和cleavedcaspase-3阳性骨细胞百分率进一步增多(p<0.01)。在术后12w,增高的tunel和cleavedcaspase-3阳性骨细胞百分率下降。3.免疫组化结果显示:tnf-α、rip1、rip3蛋白在骨细胞胞浆中均有表达,tnf-α阳性骨细胞百分率在ovx术后4w表达明显增加(p<0.01),rip1、rip3阳性骨细胞百分率在ovx术后4w表达增加不明显,tnf-α、rip1、rip3阳性骨细胞百分率在ovx术后8w较0w均显著增多(p<0.01),但术后12w,增高的阳性骨细胞百分率下降。4.荧光定量pcr和westernblot结果显示:骨组织tnf-α、rip1、rip3蛋白表达在ovx术后4w较0w组表达有所增加,但无统计学差异。ovx术后8wtnf-α(p<0.01)、rip1(p<0.05)、rip3(p<0.05)蛋白表达较0w组明显增强。但术后12w,增高的tnf-α、rip1、rip3蛋白表达下降;骨组织tnf-α、rip1mrna表达在ovx术后4w较0w组表达明显增加(p<0.05),而rip3mrna表达增加不明显;术后8wtnf-α(p<0.01)、rip1(p<0.01)、rip3(p<0.05)mrna表达较0w组明显增强,但术后12w,增高的tnf-α、rip1、rip3mrna表达下降。结论:1.在ovx大鼠骨质疏松症的发病过程中,骨细胞发生了程序性坏死,且ovx术后8w是骨细胞程序性坏死的高峰期。2.tnf-α可能是骨细胞发生程序性坏死的触发因素。第二部分necrostatin-1通过抑制ovx大鼠骨细胞发生rip1/3依赖的程序性坏死延缓骨质疏松症的进展目的:应用程序性坏死抑制剂necrostatin-1(nec-1)干预ovx大鼠,探讨nec-1能否通过抑制骨细胞发生程序性坏死而延缓骨质疏松症的进展。方法:1.将sd大鼠随机分为ovx(卵巢切除术,48只)和control(12只)两组,分别行卵巢切除术和假手术。并将ovx组大鼠再分为4组:ovx+vehicle组、ovx+nec-1组、ovx+z-vad组、ovx+e2组。在ovx术后4w,分别给予ovx+nec-1组、ovx+z-vad组、ovx+e2组大鼠腹腔注射nec-1、z-vad、e2,每日一次共4w。2.应用tunel+cleavedcaspase-3荧光染色观察并比较不同干预对骨细胞发生凋亡或程序性坏死的影响;电镜观察不同干预对骨细胞形态变化的影响;micro-ct观察不同干预对骨组织微结构变化的影响;elisa检测不同干预对血清pinp及ctx变化的影响;应用荧光定量pcr、westernblot测定不同干预对骨组织cleavedcaspase-3、rip1、rip3、mlkl表达情况的影响,并通过激光共聚焦观察不同干预对rip1-rip3共表达阳性骨细胞百分率变化的影响。结果:1.nec-1可以明显抑制骨细胞程序性坏死的发生,从而降低tunel阳性骨细胞的百分率(p<0.01)。2.应用nec-1处理ovx大鼠后,rip1mrna和蛋白水平的增高得以控制,mlkl的蛋白表达减少(p<0.01)。而应用z-vad干预后,caspase-3mrna和蛋白水平明显下降(p<0.01)。激光共聚焦显微镜可观察到:nec-1可以降低rip1-rip3蛋白共表达阳性骨细胞百分率(p<0.01)。3.应用nec-1或z-vad干预后,ovx大鼠的骨吸收减少而骨形成增加,组织微结构退变减轻(p<0.01)。1.nec-1可以有效抑制ovx大鼠骨细胞发生程序性坏死,从而延缓骨组织的退变。2.骨细胞发生的程序性坏死和凋亡两种死亡方式均参与了ovx大鼠骨质疏松症发病过程。第三部分tnf-α诱导mlo-y4骨细胞发生rip1/3依赖的程序性坏死及其机制研究目的:探讨tnf-α能否诱导小鼠长骨骨样细胞(mlo-y4)发生程序性坏死,旨在从细胞水平阐明tnf-α可能是诱导骨细胞发生程序性坏死的重要原因并探讨其机制。方法:首先用tnf-α处理mlo-y4细胞,分别在12、24、36、48小时收集标本,应用流式细胞仪检测mlo-y4凋亡和坏死率,找出tnf-α诱导细胞死亡高峰的最佳时间点。然后用nec-1、z-vad、rip3-sirna干扰片段预处理mlo-y4细胞后再用tnf-α诱导细胞,用流式细胞仪检测mlo-y4凋亡和坏死率,透射电镜观察细胞形态学变化,用westernblot、激光共聚焦检测rip1、rip3、cleavedcaspase-3、mlkl、drp1蛋白表达。应用荧光酶标仪检测各组细胞活性氧水平。结果:tnf-α诱导mlo-y4细胞24小时凋亡或坏死率达到高峰。与tnf-α组相比,z-vad、nec-1、rip3-sirna均能降低mlo-y4的凋结论:亡或坏死率(P<0.01)。在TNF-α组可见大量坏死样结构的MLO-Y4,在Z-VAD组仍可见到坏死样结构的MLO-Y4,而在Nec-1和RIP3-siRNA组未见发生明显发生坏死的MLO-Y4。与TNF-α组比较,Nec-1可显著降低RIP1-RIP3蛋白共表达阳性细胞百分率(P<0.01),而Z-VAD对其无影响。Western blot结果显示:与TNF-α组比较,Nec-1可明显抑制RIP1、MLKL、Drp1蛋白表达,而Z-VAD对RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达无影响,RIP3-siRNA可有效降低RIP3、MLKL、Drp1蛋白表达(P<0.01)。与对照相比,TNF-α组的ROS水平明显增高(P<0.01)。与TNF-α组相比,Nec-1、Z-VAD及RIP3-siRNA均能有效抑制ROS水平(P<0.01)。结论:1.TNF-α能诱导MLO-Y4细胞发生程序性坏死。2.RIP1和RIP3在MLO-Y4细胞发生程序性坏死过程中发挥了关键作用。3.MLKL和Drp1可能是MLO-Y4细胞发生程序性坏死的下游信号分子,ROS可能是MLO-Y4细胞程序性坏死的执行者。