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背景:肺成纤维细胞异常转化和肺泡上皮细胞衰老是肺纤维化的主要病理特征。海藻糖具有许多潜在的医学应用,特别是在治疗神经退行性疾病方面。有研究证实海藻糖具有抗肺纤维化作用,但其作用机制尚未阐明。本论文将从肺纤维化涉及的肺成纤维细胞转化和肺泡上皮细胞衰老两个重要病理过程探究海藻糖抗肺纤维化的细胞分子机制。实验内容及方法:1.海藻糖抑制转化生长因子-β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)诱导肺成纤维细胞转化的作用及机制(1)不同剂量、不同时间点给予海藻糖处理后,Western blot检测TGF-β1诱导肺成纤维细胞转化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达水平;(2)海藻糖处理肺成纤维细胞MRC-5细胞48 h后,Western Blot检测基质蛋白I型胶原蛋白(collagen I,COL1A1)的表达水平;(3)海藻糖处理TGF-β1刺激的含有MRC-5细胞胶原凝胶48 h后,定量胶原胶面积的大小来判断细胞收缩能力的变化(胶原胶收缩试验);(4)细胞免疫荧光染色分析海藻糖处理成纤维细胞MRC-5细胞48 h后细胞质中细胞肌丝(F-actin)形成的变化情况;(5)Western blot检测海藻糖处理MRC-5细胞后自噬标志蛋白---LC3Ⅱ的表达变化情况,以及联合应用自噬形成抑制剂3-甲基腺嘌呤、自噬流阻断剂氯喹/巴弗洛霉素-A1处理细胞后,分别检测α-SMA的表达变化情况;(6)海藻糖处理TGF-β1刺激的肺成纤维细胞MRC-5细胞后,Western blot检测总Smad2/3蛋白和磷酸化Smad2/3蛋白表达水平;(7)采用稳定同位素标记氨基酸细胞培养技术(Stable isotope labeling by amino acid in cell culture,SILAC)定量蛋白质组学方法结合Metascape软件分析来筛选海藻糖抑制肺成纤维细胞转化过程中表达水平发生变化的蛋白质;(8)联合应用β-连环蛋白(β-catenin)激动剂-SKL2001处理MRC-5细胞48 h后,Western blot检测肺成纤维细胞中α-SMA的蛋白表达水平。2.海藻糖抑制肺泡上皮细胞衰老的作用及其机制初步研究(1)博来霉素刺激肺泡上皮细胞A549细胞48 h后,Western blot检测p21的蛋白表达水平变化;(2)博来霉素处理肺泡上皮细胞A549细胞48 h后,衰老相关β-半乳糖苷酶(Senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)染色法进行细胞染色;(3)不同剂量海藻糖处理博来霉素刺激的肺泡上皮细胞A549细胞48 h后,Western blot检测p21蛋白表达水平变化;(4)海藻糖处理肺泡上皮细胞A549细胞48 h后,Western blot检测细胞中自噬标志蛋白---LC3II的表达情况;(5)海藻糖联合自噬形成抑制剂3-甲基腺嘌呤、自噬流阻断剂氯喹/巴弗洛霉素-A1处理肺泡上皮细胞48 h后,Western blot检测p21蛋白表达变化;(6)海藻糖处理博来霉素诱导的肺泡上皮细胞A549细胞48 h后,Western blot检测p53和纤溶酶原激活物抑制剂1(Plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)蛋白表达水平。实验结果1.海藻糖抑制转化生长因子-β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)诱导肺成纤维细胞转化的作用及机制(1)海藻糖以剂量依赖和时间依赖的方式显著抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞MRC-5细胞中α-SMA的表达水平;(2)海藻糖明显抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞MRC-5细胞中基质蛋白I型胶原蛋白(collagenI,COL1A1)的生成;(3)海藻糖显著降低TGF-β1诱导的含有MRC-5细胞胶原凝胶的收缩程度;(4)海藻糖明显减少TGF-β1诱导的MRC-5细胞中细胞肌丝的形成;(5)海藻糖能够激活肺成纤维细胞MRC-5细胞自噬,但是抑制自噬不能逆转海藻糖对肺成纤维细胞转化的抑制作用;(6)海藻糖不通过调控经典TGF-β/Smad2/3通路来抑制肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞转化;(7)基于SILAC的蛋白质组学方法结合Metascape软件分析筛选出海藻糖处理组与TGF-β1组蛋白表达差异最为显著的蛋白β-catenin,并且海藻糖的确下调了 TGF-β1诱导的肺成纤维细胞MRC-5细胞中β-catenin的蛋白表达水平;(8)β-catenin激动剂---SKL2001能够逆转海藻糖对肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞转化的抑制作用。2.海藻糖抑制肺泡上皮细胞衰老的作用及其机制初步研究(1)博来霉素刺激肺泡上皮细胞A549细胞能显著增加细胞中p21蛋白表达水平;(2)博来霉素处理明显增加衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性的A549细胞数量;(3)海藻糖以剂量依赖方式显著抑制博来霉素诱导的肺泡上皮细胞A549中p21蛋白表达水平;(4)海藻糖明显增加肺泡上皮细胞A549中LC3II蛋白表达水平;(5)抑制自噬不能逆转海藻糖对肺泡上皮细胞衰老的抑制作用;(6)海藻糖能够抑制博来霉素诱导的肺泡上皮细胞中p53和PAI-1蛋白表达实验结论(1)海藻糖能够抑制肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞转化,该作用与其下调β-catenin水平有关,但与自噬途径以及经典TGF-β/Smad2/3通路无关。(2)海藻糖能够抑制肺泡上皮细胞衰老,此作用可能与其抑制PAI-1/p53轴有关,但与海藻糖激活自噬无关。