基因克隆已成为科学研究中最常用的技术之一。这一过程中的一个限制步骤是通过使用限制性内切酶和DNA连接酶将目标DNA定向插入克隆载体。这一程序受到几个限制,包括连接不紧密,以及在插入片段和载体中提供独特的限制位点。随着代谢工程和合成生物学的出现和发展,对克隆方法的要求也越来越高。一些不依赖于连接酶的DNA克隆方法尽管克服了酶切位点的限制,但成本较高,费时费力。近来,基于同源重组的克隆方法越来越受到大家的青睐。本研究中,我们提出了一种基于T5核酸外切酶DNA克隆/装配方法（Cool Cloning）。通过PCR引物设计扩增,将插入片段的两端分别带上与线性载体两端同源的末端;在含有T5核酸外切酶的体系中,冰浴5 min,利用T5核酸外切酶的5′-3′外切酶活性,使线性载体和插入片段形成互补的黏性末端,在体外进行自退火,然后转入大肠杆菌感受态细胞,借助细胞内的修复系统完成缺刻修复和共价连接。该方法还可以同时完成多个DNA片段的组装。反应混合物简单,每次反应使用0.5 U的T5核酸外切酶。本论文对酶浓度、反应时间、反应温度、DNA用量、同源臂长度等条件做了优化,2片段组装的效率可以达到95%以上。本研究提出的Cool Cloning方法的研究具有以下特点:（1）反应利用T5核酸外切酶来使载体和插入片段产生长的互补黏性末端,提高了重组效率;（2）Cool Cloning冰浴反应5 min后可以直接转化大肠杆菌细胞,操作简单,易于大规模的高通量操作,可以快速的完成DNA分子组装;（3）组装阳性率高,可以获得高于95%阳性克隆;（4）组装可以同时完成多个DNA片段的组装。