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目的:研究MAF-1碳端功能结构域第128~153位26个氨基酸肽段(MAF-1A)的结构特征、抗真菌活性特点、细胞毒性、抗菌机理以及对白色念珠菌致病性的影响,为发掘天然家蝇抗真菌肽MAF-1的药物开发潜力,筛选高效、安全的新型抗真菌肽类模体或药物,以及进一步研究家蝇的先天免疫机制提供理论基础和科学依据。 方法:1.采用生物学信息技术分析MAF-1A的结构特征,FMOC固相合成,微量液体-菌落记数法检测该肽体外抗真菌活性。2.采用液体微量稀释法、MTT法和平板菌落计数法检测MAF-1A对常见致病性酵母菌抗菌活性及最小抑菌浓度和最小杀真菌浓度,绘制时间-杀菌曲线,并观察金属离子、FITC荧光标记、胎牛血清和胰蛋白酶对其抗真菌活性的影响;采用分光光度法和MTT法检测MAF-1A对人血细胞溶血性、人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的毒性作用以及宫颈癌Hela细胞体外增殖的抑制作用。3.采用FITC荧光标记、激光扫描共聚焦显微镜、电镜、流式细胞仪等技术观察MAF-1A对白色念珠菌形态和结构的影响及其在细胞中的分子定位;采用DNA/RNA-肽结合凝胶阻滞实验、DNaseⅠ足迹试验法、光谱分析等方法研究MAF-1A对DNA/RNA结构及其功能的影响。4.测定MAF-1A在MIC浓度下白色念珠菌的孢子萌发率及芽管形成率,采用瑞氏染色显微镜计数,观察在不同浓度MAF-1A预处理后及干预下,酵母相和菌丝相白色念珠菌定植人口腔黏膜上皮细胞(BEC)能力变化。5.采用氨基酸残基替换法对MAF-1A进行结构改造,生物学信息技术分析其结构特征,FMOC固相合成,并检测改造多肽的体外抗真菌活性及人红细胞溶血性。 结果:1.MAF-1A为一α螺旋线性肽,分子量3022.5Da,pI值9.23呈碱性,携带2个正电荷,保留MAF-1基本特征,N端富含赖氨酸(Lys),碱性氨基酸占总氨酸的26.9％;平均疏水指数-1.081;不具备跨膜结构,具有一个蛋白激酶C磷酸化结合位点和一个蛋白质结合位点,具有白色念珠菌抗菌活性。2.MAF-1A对白色念珠菌敏感株及耐药菌均显示出抗菌活性,0.1mg/ml浓度MAF-1A和氟康唑抗白色念珠菌效果相似;对常见致病性酵母菌MIC为0.1~0.8mg/ml、MFC为0.2~0.9mg/ml。杀菌曲线显示MAF-1A作用真菌2h至14h逐渐发挥抗菌作用,呈现先杀菌后抑菌效应。在含有NaCL或MgCL2环境中以及N端标记FITC后,MAF-1A的杀菌效果减弱;与胎牛血清及胰蛋白酶作用后丧失抗真菌活性。MAF-1A无溶血活性;对人hBMSCs细胞无毒性作用;对Hela细胞表现出增殖抑制作用,随着MAF-1A浓度增加抑制作用增强。3.采用荧光标记技术证实MAF-1A约3h后吸附白色念珠菌细胞表面,进入细胞后逐步在细胞内聚集。MAF-1A作用12h和24h培养物扫描电镜显示,菌体细胞表面粗糙、凹凸不平、穿孔、菌体破裂胞质流失、细胞皱缩,随着时间延长病变加重;透射电镜发现细胞膜多处不连续环形缺口,部分细胞可见胞核碎裂,细胞器模糊不清,胞浆原生质紊乱,并出现多个斑片状低电子密度区。MAF-1A作用细胞后细胞表面疏水性降低,流式细胞技术进一步证实MAF-1A破坏细胞膜影响其完整性。MAF-1进入细胞可与DNA或RNA结合,结合核苷酸序列无特异性,且与RNA的结合能力强于DNA;光谱分析结果证实,MAF-1A可能通过静电结合或沟槽作用与DNA或RNA结合,随着肽-DNA复合物的形成逐渐破坏DNA的双螺旋结构使得DNA结构变得松散、断裂;RT-PCR结果显示MAF-1A作用真菌细胞后膜结构基因或耐药基因表达均不同程度的上调,作用12h时的上调水平高于24h。4.MAF-1A作用白色念珠菌后,芽生孢子萌发率及芽管形成率小于药物阳性对照和阴性对照组(P<0.05);MAF-1A可减少白色念珠菌酵母相细胞或菌丝相细胞对人BEC细胞的粘附数,且减少酵母相细胞粘附作用强于菌丝相细胞(P<0.05)。5.采用氨基酸替换法改造后的多肽MAF-1B抗真菌谱同MAF-1A,抗菌活性提高,但溶血性有所增加,提示可以MAF-1A为模体,对天然抗真菌肽MAF-1功能结构域关键氨基酸结构进行进一步研究。 结论:1.MAF-1A具有抗真菌活性,为一新的抗真菌α-螺旋线性多肽,分子量3022.5Da,pI值9.23呈碱性,不具备跨膜结构,含有一个蛋白激酶C磷酸化结合位点和一个蛋白质结合位点,结构不同于已发现的昆虫抗菌肽;MAF-1A为MAF-1的结构功能域中一个重要组成结构。2.MAF-1A对包括耐药菌株在内的多种念珠菌和新生隐球菌具有抗菌活性,并呈现先杀菌后抑菌、抗菌有一定选择性的特点;对人hBMSCs细胞无毒性作用,无溶血活性,但对Hela细胞增殖具有抑制作用。3.MAF-1A可同时通过作用细胞膜及DNA、RNA等细胞内靶点发挥抗真菌生物效应。4.MAF-1A可通过抑制白色念珠菌芽生孢子萌发和芽管的形成以及有效降低白色念珠菌对人BEG细胞粘附能力,降低白色念珠菌的致病能力。5.本实验结果为研究家蝇抗真菌肽MAF-1抗真菌机理及筛选高效、安全的新型抗真菌肽类模体或药物以及进一步研究家蝇的先天免疫机制奠定了科学基础。