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目的:通过临床实验,探讨银屑病患者与健康人皮肤组织中Spred蛋白表达差异,明确Spred蛋白与银屑病相关性;同时通过对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠实验,明确银屑病中Spred-1蛋白与Ras/ERK信号通路的相关性,并基于Spred-1/Ras/ERK信号通路研究清血毒颗粒合剂治疗银屑病可能机制。方法:1.纳入符合要求的15例健康对照和30例寻常型银屑病患者,通过组织免疫荧光检测,观察银屑病患者皮损区、近皮损区、非皮损区及正常人表皮组织中Spred-1、Spred-2、Spred-3蛋白表达定位和丰度,同时观察两组样本之间蛋白表达的差异。2.BALB/c雄性小鼠随机分为正常组、模型组、过表达Ⅰ、Ⅱ组、空载病毒Ⅰ、Ⅱ组,每组8只。过表达Ⅰ、Ⅱ组、空载病毒Ⅰ、Ⅱ组小鼠分别尾静脉注射对应病毒,模型组和正常组注射生理盐水。2天后,模型组、空载病毒Ⅰ组、过表达Ⅰ组小鼠采用IMQ造模,过表达Ⅱ组、空载病毒Ⅱ组、正常组小鼠予以凡士林外搽对照,连续7天,第8天后处死取样。实验观察小鼠PASI评分变化;并对样本进行组织病理观察Spred-1过表达对银屑病样小鼠模型皮损组织病理影响;同时进行Western blot和RT-PCR实验观察银屑病样小鼠皮损区、近皮损区、非皮损区Spred-1蛋白及皮损区Ras/ERK通路相关蛋白表达。3.雄性BALB/c小鼠随机分为清血毒颗粒组、复方青黛胶囊组、模型组、正常组,每组8只。前三组采用IMQ造模,正常组小鼠予以凡士林外搽对照;搽药2h后,模型组、正常组用蒸馏水灌胃,清血毒颗粒组、复方青黛胶囊组用相应药物灌胃;实验连续进行7天后,第8天后处死取样。实验过程观察小鼠PASI评分变化;并对样本进行组织病理观察清血毒颗粒合剂对银屑病样小鼠模型皮损组织病理影响;同时进行Western blot及RT-PCR实验观察清血毒颗粒合剂对银屑病样小鼠皮损区、近皮损区、非皮损区Spred-1/Ras/ERK通路相关蛋白表达。结果:1.在临床实验部分,Spred-1蛋白在正常人的表皮层全层及真皮层均有表达,但主要集中在基底层、棘层和颗粒层下部,真皮层、角质层和颗粒层上部表达低。Spred-2蛋白表达于表皮层全层,除基底层、真皮层表达较弱外,在其他部位表达强。Spred-3蛋白在棘层、颗粒层下部及角质层均有表达,在基底层及真皮层无表达。同时与正常人相比Spred-1、Spred-2、Spred-3在银屑病皮损区、近皮损区、非皮损区中表达位置一致,但平均荧光密度值下降(P<0.05)。2.在动物实验中,我们首先验证了Spred-1过表达腺病毒。通过Western blot和RT-PCR实验,我们发现在过表达Ⅱ组中Spred-1蛋白及m RNA表达升高,与空载病毒Ⅱ组和正常组相比有统计学意义(P<0.001),说明Spred-1过表达腺病毒能在体内正常表达;同时空载病毒Ⅱ组与正常组相比Spred-1蛋白及m RNA表达差异无统计学意义(P>0.05);以上结果表明Spred-1过表达腺病毒尾静脉注射后能在小鼠体内正常过表达,而空载病毒对小鼠无影响。同时三组小鼠实验过程未见皮损产生,皮肤病理表现相似,且平均表皮厚度组间比较未见统计学意义(P>0.05),说明Spred-1过表达腺病毒及空载病毒不能产生自发性皮损且对正常皮肤病理无明显影响。3.在Spred-1过表达实验中,模型组小鼠从实验第4-5天可见少许红斑、鳞屑,随后红斑增多、皮损浸润增厚、鳞屑成层,最严重症状出现时间约在实验第7-9天之中;与模型组相比,空载病毒Ⅰ组与模型组皮损严重程度、皮疹变化时间及皮肤病理表现相似,两组PASI评分相比无显著差异(P>0.05),皮肤平均表皮厚度及病理Baker评分两组相比亦无统计学意义(P>0.05),说明空载病毒体内注射后对IMQ诱导的银屑病皮损、病理无影响;而过表达Ⅰ组小鼠皮损严重程度整体轻于模型组及空载病毒Ⅰ组,PASI评分与后两组相比有显著差异(P<0.05),平均表皮厚度及病理Baker评分较模型组及空载病毒Ⅰ组显著降低(P<0.05),说明Spred-1过表达在一定程度上能减轻IMQ诱导的银屑病样皮损。4.在Spred-1蛋白过表达实验中,Spred-1蛋白过表达后,过表达Ⅰ组p-Ras、p-Raf1、p-ERK1/2、VEGF蛋白及Ras、Raf1、ERK1/2、VEGF的m RNA表达与模型组及空载病毒Ⅰ组相比显著下降(P<0.001),说明Spred-1蛋白表达升高后抑制Ras/ERK通路相关蛋白及m RNA表达,并且能缓解银屑病样小鼠症状;而空载病毒Ⅰ组与模型组相比,两组Ras、p-Ras、Raf1、p-Raf1、ERK1/2、p-ERK1/2、VEGF的蛋白及m RNA表达无统计学意义(P>0.05),说明空载病毒对Ras/ERK通路m RNA表达无影响。5.在中药干预实验中,与模型组相比,清血毒颗粒组、复方青黛胶囊组红斑、浸润肥厚等症状程度更轻,PASI评分减低(P<0.05),皮肤平均表皮厚度及病理Baker评分下降明显(P<0.05),说明清血毒颗粒合剂和复方青黛胶囊对IMQ诱导的银屑病样小鼠有一定的治疗功效。对比清血毒颗粒组与复方青黛胶囊组,我们发现清血毒颗粒组小鼠红斑、浸润、鳞屑等症状消退速度较复方青黛胶囊更快,PASI评分明显低于复方青黛胶囊组(P<0.05),皮肤平均表皮厚度及病理Baker评分两组亦有显著差异(P<0.05),以上结果提示清血毒颗粒合剂对银屑病样小鼠皮损改善作用优于复方青黛胶囊。6.在中药干预实验中,我们应用清血毒颗粒合剂治疗银屑病样小鼠,发现治疗后银屑病样小鼠皮损区、近皮损区、非皮损区中Spred-1 m RNA表达升高,而皮损区p-Ras、p-Raf1、p-ERK1/2、VEGF蛋白及Ras、Raf1、ERK1/2、VEGF的m RNA表达降低(P<0.001),说明清血毒颗粒合剂能够通过干预Spred-1/Ras/ERK通路达到治疗银屑病的目的。复方青黛胶囊治疗IMQ诱导的银屑病样小鼠后三区域中Spred-1 m RNA变化无统计学意义(P>0.05),而皮损区p-Ras、p-Raf1、p-ERK1/2、VEGF蛋白及Ras、Raf1、ERK1/2、VEGF的m RNA表达降低(P<0.001),说明复方青黛胶囊可能是通过其他途径调节Ras/ERK通路。结论:1.Spred-1、Spred-2、Spred-3蛋白表达于正常人表皮全层,但在各层表达具有细微差别;同时,三种蛋白在银屑病皮损区、近皮损区、非皮损区表达定位与正常人表达一致,但平均荧光密度值降低。2.在银屑病样小鼠皮肤组织中,Spred-1蛋白表达降低,Ras/ERK通路相关蛋白及m RNA表达升高;Spred-1过表达后能够抑制Ras/ERK通路相关蛋白表达,缓解银屑病小鼠症状。3.通过提高Spred-1蛋白表达,抑制Ras/ERK通路相关蛋白表达可能是清血毒颗粒合剂能治疗银屑病的机制之一。