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研究背景及目的喉癌是我国北方地区发病率较高的肿瘤之一,发病率约占全身肿瘤的1~5%。尽管目前在喉癌的诊断和治疗方面取得了很大进展,但部分喉癌患者预后差,生存率低。对于晚期不能手术和术后复发的患者,常采用化学治疗方法,但化疗效果不佳,推测与喉癌细胞对化疗药物耐药有关。肿瘤细胞的多药耐药是化疗失败的主要原因之一,喉癌的化疗药物的耐药常表现为多药耐药。逆转肿瘤细胞的耐药一直是肿瘤研究的一个重点,近年来通过mi RNAs逆转肿瘤耐药的研究取得了进展,但应用mi RNAs针对喉癌多药耐药的干预研究较少。本论文采用微阵列芯片技术研究喉鳞癌及癌旁正常黏膜中mi RNAs表达谱差异,筛选参与喉癌发生的特异mi RNAs。通过比较特异mi RNA在亲本细胞Hep-2细胞与VCR耐药细胞株Hep-2/v之间的表达差异验证与喉癌多药耐药有关的mi RNAs。材料和方法分离8例喉癌组织及其对应癌旁正常黏膜中的mi RNA,采用荧光染料Cy3标记,并与制备好的哺乳动物mi RNA芯片V3.0杂交,用Lux Scan 10K/A扫描仪扫描荧光信号,采用Lux Scan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析,用SAM和Cluster3.0软件进行差异基因筛选和聚类分析,对部分差异表达mi RNA采用RNA加尾和引物延伸实时定量RT-PCR法对芯片检测结果进行验证。通过给予50u M、100u M和200u M的顺铂作用Hep-2/v细胞。应用细胞增殖实验、Tunel细胞凋亡确定Hep-2和Hep-2/v对顺铂耐药的差别,确认Hep-2/v耐药株存在多药耐药性。采用Poly加尾PCR的方法检测正常咽上皮细胞NP69,Hep-2和Hep-2/v细胞mi R-133a的水平;采用免疫荧光染色和PCR、Western Blotting方法同时检测两种细胞在加入顺铂后ATP7B的变化。采用慢病毒重组载体p EZX-mi R-133a转染Hep-2细胞和Hep-2/v耐药细胞株,CCK8细胞活力实验观察不同浓度顺铂对细胞存活的影响;通过免疫荧光染色和实时定量PCR方法检测p EZX-mi R-133a转染细胞ATP7B的转录和蛋白表达变化。结果1.通过mi RNA表达谱分析共筛选出47个喉癌相关的差异表达mi RNAs基因,包括24个在喉癌组织中表达下调的mi RNAs和23个在喉癌组织中表达上调的mi RNAs。其中在喉癌组织中下调5倍以上的有mi R-1、mi R-486-5p、mi R-206、mi R-487a、mi R-375、mi R-422a、mi R-144、hsa-mi R-384、mi R-378和mi R-133a共10个。在喉癌组织中表达上调3倍以上的mi RNA有3个,分别是mi R-93、mi R-31和mi R-20b。在喉癌差异表达的mi RNA中有13个成5簇共表达,分别位于8、13、14、18和X染色体上。荧光定量RT PCR结果与mi RNAs芯片的结果较符合。2.50u M和100u M的顺铂作用24h后,Hep-2细胞存活为71%和73%,而对Hep-2/v的细胞的存活没有影响统计学分析有显著差异(p<0.01);Hep-2/v的生存在100u M时为85%明显高于同剂量的Hep-2细胞(p<0.05);50u M的顺铂作用Hep-2细胞24h,细胞凋亡指数为31.12±4.75,Hep-2/v细胞的凋亡指数仅为3.5±1.23,卡方检验p<0.01;Hep-2/v细胞的ATP7B蛋白表达明显高于Hep-2细胞。3.顺铂作用后Hep-2和Hep-2/v表达ATP7B蛋白与对照组相比增强。实时定量PCR检测顺铂作用后不同时间ATP7A和ATP7B基因转录变化,结果发现50u M顺铂能够诱导Hep-2和Hep-2/v表达ATP7B,Hep-2/v细胞在作用后3h表达增强,6h达到峰值,持续表达24h无明显变化。Hep-2细胞和Hep-2/v表达ATP7B的荧光值明显高于NP-69细胞。4.Hep-2细胞mi R-133a的表达量与NP-69细胞相比下降4.76±0.54倍,Hep-2/v细胞的mi R-133a的表达量与NP-69相比下降5.55±0.14倍。重组慢病毒介导mi R-133a转染Hep-2细胞和Hep-2/v细胞48h后CCK8检测细胞存活。结果显示顺铂50u M和100u M作用组,转染p EZX-Control的Hep-2/v细胞存活明显高于转染p EZX-mi R-133a的Hep-2/v细胞;mi R-133a能够降低Hep-2/v细胞ATP7B的转录和表达。结论mi R-133a在喉癌组织中表达下调,喉癌组织中差异表达的mi R-133a可能是参与喉癌的发生的因素之一。喉癌耐药细胞Hep-2/v的ATP7B蛋白表达明显高于Hep-2细胞,ATP7B蛋白表达增高为喉癌细胞对顺铂耐药的研究提供了一个新思路。实验中发现了mi R-133a能重新提高喉癌耐药细胞对顺铂的化疗敏感性这一现象,推测其机制可能与mi R-133a下调ATP7B蛋白表达有关。