肺腺癌是原发性肺癌的一种常见的病理类型,约占肺癌总发病人数的30%。由于肺腺癌多发于肺周边,且早期即可侵犯血管和淋巴管而发生远处转移,因此,多数肺腺癌在初诊时已是晚期,失去了手术治疗的时机。目前对肺腺癌患者的治疗以化疗及放疗为主。尽管随着新型辅助化疗药物及肺癌靶向药物的临床应用,肺腺癌患者的生存质量得到了显著改善,但由于肺癌病情进展快,且部分患者对化、放疗存在耐受性差、耐药性强等问题,总体治疗效果并不满意。据统计,中晚期肺癌患者的5年生存率低于15%。因此,寻找安全而有效的辅助治疗方法,以提高对肺腺癌的治疗效果是临床亟待解决的问题。二甲双胍是一种胰岛素增敏剂,多年来被广泛应用于对2型糖尿病患者的降血糖治疗。近年来的临床研究观察到,二甲双胍对肿瘤患者似乎有一定程度的保护作用,能够降低肿瘤的发生率和肿瘤相关死亡率。这一现象近期已得到了部分基础研究的证实。通过对乳腺癌、结直肠癌及前列腺癌等的研究发现,二甲双胍具有一定程度的抗肿瘤活性。然而,二甲双胍对肺腺癌的生长增殖是否具有相似的抑制作用尚未见报道;其发挥抗肿瘤活性的机制至今仍不清楚。本课题从细胞实验出发,检测了二甲双胍对肺腺癌细胞增殖的作用及其与顺铂联合作用对肺腺癌生长的影响,并通过分子生物学的方法对其作用机制进行了研究;最后通过动物实验对前期结果加以证实,并初步评价了二甲双胍作为一种抗癌药物应用于临床的可行性。全文共包括四部分内容:第一部分二甲双胍对肺腺癌细胞体外增殖的作用研究目的:研究二甲双胍对体外培养的肺腺癌细胞株的增殖、细胞周期、凋亡等方面的作用,观察二甲双胍与顺铂联合使用对细胞生长的影响。方法:以0、0.5、2、8mmol/L四种浓度的二甲双胍分别对肺腺癌细胞株A549和NCI-H1299进行体外干预,在第0、24、48和72h,以MTT法检测各组细胞的增殖情况。将上述各浓度的二甲双胍与顺铂(10ug/mL)联用后,再次检测药物干预不同时间后细胞的活性变化。选取A549细胞株为主要研究对象,以二甲双胍干预48h后,采用流式细胞术检测各组细胞在细胞周期及早期凋亡率等方面的差异。结果:(1)与对照组相比,二甲双胍2mmol/L组和8mmol/L组细胞的增殖活性在药物作用24h后即明显下降,以后者的下降更为明显;0.5mmol/L组细胞在药物作用48h后也呈显著的生长抑制。随着干预时间延长,二甲双胍对各组细胞增殖的抑制更加显著。(2)二甲双胍与顺铂联合使用时,对肺腺癌细胞增殖的抑制作用较单用顺铂更强;二甲双胍的浓度越高、对细胞干预的时间越长,该抑制作用越明显。(3)二甲双胍干预A549细胞48h后,与对照组相比,0.5mmol/L组细胞的周期分布及早期凋亡率均无明显变化;2mmol/L组G1期细胞所占比重显著增高(P<0.05),而S期细胞比重显著降低(P<0.01),细胞的早期凋亡率显著增加(P<0.05);8mmol/L组G1期细胞所占比重显著升高,S期和G2/M期细胞则相应减少,细胞的早期凋亡率也明显增高(均P<0.01)。结论:二甲双胍可以使细胞周期循环阻滞于G1期,并诱导细胞的早期凋亡增加,从而有效抑制肺腺癌细胞株的体外增殖,其作用呈浓度及时间依赖性增强;二甲双胍与顺铂共同作用可以增强对肺腺癌细胞生长的抑制作用。第二部分JNK/p38 MAPK--Caspase信号传导通路在二甲双胍诱导肺腺癌细胞凋亡中的作用研究目的:研究二甲双胍对A549细胞内AMPK、JNK、p38 MAPK的磷酸化蛋白及Caspase家族蛋白表达水平的影响,探讨JNK/p38 MAPK--Caspase信号传导通路在二甲双胍诱导的肺腺癌细胞凋亡中的作用。方法:以5mmol/L的二甲双胍对A549细胞进行体外干预,在干预的第0、15、30和60min时,分别抽提细胞总蛋白,以Western blot技术检测细胞内AMPK、JNK、p38 MAPK的总蛋白和磷酸化蛋白的表达;在干预后第0、12、24和48h,检测剪切后的Caspase-3、8、9活性蛋白的表达水平。选择特异性的JNK通路阻断剂SP600125和p38 MAPK通路阻断剂SB202190分别对细胞进行预处理1~2h,再进行二甲双胍(5mmol/L)干预,48h后,采用流式细胞术检测细胞早期凋亡的情况。结果:(1)二甲双胍干预前后,A549细胞内AMPK、JNK和p38 MAPK的总蛋白表达强度无显著变化。二甲双胍干预前,细胞内上述蛋白的磷酸化蛋白及剪切后的Caspase-3、8、9的表达量极低;p-AMPK、p-p38和p-JNK的表达水平在药物干预15min后即明显增强,至60min后明显衰减,而相应的总蛋白则变化不明显;Caspase-8、9活性蛋白的表达水平在药物干预12h后明显增强,24h后,Caspase-3的表达也出现增强。(2)流式细胞术检测结果提示,SP600125和SB202190本身对A549细胞的凋亡无显著影响;但使用这两种抑制剂分别对细胞进行预处理后,再行二甲双胍干预,细胞的早期凋亡率较单纯二甲双胍干预组显著降低(P<0.05)。结论:JNK/p38 MAPK--Caspase信号传导通路参与了对二甲双胍诱导的肺腺癌细胞凋亡的调控。第三部分GADD153在二甲双胍诱导肺腺癌细胞凋亡中的作用研究目的:研究二甲双胍对肺腺癌A549细胞内GADD153基因表达的影响,探讨GADD153基因在二甲双胍诱导的肺腺癌细胞凋亡中的作用。方法:以5mmol/L的二甲双胍对A549细胞进行体外干预,在第0、12、24、48和72h,抽提细胞总RNA,采用Realtime-PCR技术检测各时间点A549细胞内GADD153 mRNA的相对表达量。设计并合成GADD153靶向siRNA,将其转染入A549细胞,通过RNA干扰特异性的抑制细胞内GADD153基因及蛋白的表达。采用Realtime-PCR和Western blot技术验证对目的基因的干扰效率。以5mmol/L的二甲双胍干预GADD153基因干扰后的A549细胞,采用流式细胞术检测药物干预48h后细胞的早期凋亡率。结果:(1)二甲双胍作用12h后,A549细胞内的GADD153 mRNA表达水平即显著增高(P<0.01);随药物干预时间的延长,该基因的表达增高更加明显,至72h升至最高,约为干预前的14.12倍。(2)GADD153 siRNA转染可以有效地抑制A549细胞内GADD153基因的表达,干扰效率达86%左右。(3)流式细胞术检测结果显示,GADD153基因干扰对于A549细胞的早期凋亡无显著影响;经二甲双胍干预48h后,GADD153干扰的A549细胞的早期凋亡率与未干扰的细胞相比明显降低(P<0.05)。结论:GADD153基因及蛋白的表达增高可促进二甲双胍诱导的肺腺癌细胞的凋亡。第四部分二甲双胍抑制肺腺癌裸鼠皮下移植瘤生长的实验研究目的:通过构建肺腺癌的裸鼠皮下移植瘤模型,研究二甲双胍对于肺腺癌体内生长的影响及安全性,并探讨二甲双胍在临床抗肿瘤治疗方面的价值。方法:将人肺腺癌细胞A549接种至BALB/c-nu小鼠腋背部皮下,建立移植瘤动物模型。待移植瘤长至约100mm3左右时,选取瘤块大小、形状较均一的裸鼠,随机分为3组,每组5只,以腹腔注射的方式给药治疗,每日1次,持续1个月。对照组给予PBS 0.2ml/d;met40组给予二甲双胍40mg/kg/d;met200组给予二甲双胍200mg/kg/d。观察药物干预过程中裸鼠的一般情况,每4天称量动物的体重,测量移植瘤的长短径,以计算肿块大小。治疗结束后,颈椎脱臼法处死荷瘤鼠,剥离移植瘤及肺、心、脑、肝、肾等脏器,以HE染色观察肿瘤及各器官的形态,判定肿瘤有无远处转移;以免疫组化染色检测各组移植瘤内Ki-67的表达情况;以TUNEL染色原位检测肿瘤细胞的凋亡情况。试验重复2次。结果:(1)以A549细胞接种于裸鼠右侧腋背部皮下,成功构建了肺腺癌的裸鼠皮下移植瘤模型。在为期1个月的药物干预过程中,各组裸鼠的一般状态良好,无明显异常表现,未见明显药物毒副反应。(2)在药物干预的不同时间测量移植瘤的大小,均以对照组的肿瘤体积最大,met40组其次,met200组的肿瘤体积最小。药物干预1个月后,两个二甲双胍治疗组的移植瘤平均体积均显著小于对照组(P<0.01);以对照组为参照,40mg/kg/d和200mg/kg/d剂量的二甲双胍腹腔注射给药对裸鼠移植瘤生长的抑制率分别为19.81%±6.25%和40.70%±8.98%。(3)对移植瘤标本行免疫组化染色结果显示,met40和met200组肿瘤内Ki-67抗原的阳性表达率分别为38.80%±10.41%和32.85%±10.14%,均显著低于对照组(58.18%±12.83%)(P<0.01)。(4)TUNEL染色结果显示,对照组肿瘤内仅可见散在的凋亡细胞(3.1±1.8个/HPF),而met40组和met200组肿瘤内的凋亡细胞数量显著增加(分别为13.6±3.41个/HPF和16.35±3.07个/HPF)(P<0.01),以后者增加更为明显。结论:40mg/kg/d和200mg/kg/d两种浓度的二甲双胍均可有效的抑制肺腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长速度,使肿瘤细胞的凋亡增多、增殖活性减弱,且不会引起明显的毒副反应,提示二甲双胍对于肺腺癌患者的治疗具有较好的临床应用前景。通过上述研究,得到结论如下:1、二甲双胍可以通过阻滞细胞周期于G1期,并诱导细胞凋亡,从而抑制肺腺癌细胞的体外增殖;二甲双胍与顺铂联用可增强对肺腺癌细胞的生长抑制作用。2、JNK/p38 MAPK--Caspase信号传导通路参与了对二甲双胍诱导的肺腺癌细胞凋亡的调控,阻断JNK/p38 MAPK通路可以部分地降低二甲双胍作用下肺腺癌细胞的早期凋亡率。3、二甲双胍可以诱导肺腺癌细胞内GADD153基因及蛋白表达增高,从而促进细胞凋亡。4、二甲双胍腹腔注射给药可以抑制肺腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长,降低肿瘤细胞的增殖活性、促进细胞凋亡,且无明显毒副反应。