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研究背景骨肉瘤是威胁儿童生长发育的第三大肿瘤,且其发病率仍呈现逐年升高的趋势。与此同时,肿瘤肺转移是骨肉瘤相关性致死的主要因素,并且常规化疗方案对改善转移性疾病预后生存收效甚微。另外,目前对介导肿瘤演进(包括转移)的信号异常激活机制尚有待进一步明确,阐明疾病的异常分子机制有助于提高临床诊疗能力,促进创新疗法开发和个体化精准治疗。目的比较临床原发性骨肉瘤和转移性骨肉瘤基因表达变异,鉴定与疾病分型相关表达谱及信号通路;筛选鉴定Rh2可靶向的肿瘤相关异常生物分子标志,并分析Rh2对骨肉瘤增殖、凋亡及转移的影响及机制初步探讨。方法1、运用生物信息模型预测人参皂苷Rh2潜在生物标靶,分析比对其与骨肉瘤异变关联因子并提取共同核心作用网络;2、设置人参皂苷Rh2梯度浓度,运用结晶紫染色、MTT试验验证其对转移性骨肉瘤细胞株143B和MG63的增殖抑制能力,并筛选适宜的实验条件(浓度和作用时间);3、利用JC-1染色试验检测方法2决定的浓度Rh2处理后的143B、MG63细胞线粒体膜电位变化,倒置荧光显微镜下分析药物对细胞早期凋亡的影响;4、应用划痕愈合试验、Transwell试验检测不同时间点时不同浓度Rh2对体外细胞迁移能力的影响;5、Western blot检测方法2确定浓度的Rh2处理143B、MG63细胞24h后增殖凋亡(PCNA、Caspase)和信号通路P38/p-P38水平;6、结合Limma包分析临床骨肉瘤芯片GSE14359(原发VS转移)组间表达谱差异,GSEA富集随疾病进展变异的信号通路,尝试PCA法寻找、建立临床分子分型标准。结果1、经PharmMapper受体-配体模型逆向匹配,加权统计后共获得Rh2生物靶标152个,取z检验校正值和匹配分数均大于0.9时,最佳匹配分子包含驱动样蛋白KIF11(z=0.99,fit score=0.96)、二氢乳清酸脱氢酶DHODH(z=0.95,fit score=0.93);取置信度临界值为0.04时几乎所有翻译蛋白(149个)共形成862对作用关系,PPI富集值P<1.0e-16,且骨肉瘤相关核心基因拓扑相关系数大于0.8。2、结晶紫染色显示,处理时间一定时,着色深度随Rh2浓度增加而减弱,较低浓度时相对不明显,随浓度增加变化率加剧。MTT反映同一浓度的Rh2对143B细胞的存活抑制在12、24、36h时无统计学差异(P>0.05),而仅与Rh2浓度呈依赖关系;相对地,在MG63组中Rh2浓度为40μM时仅12与24、36h组有统计学差异(P<0.05),Rh2为50、60μM时,12、24、36h组间两两有统计学差异(P<0.05);143B、MG63细胞中IC50各自约为53.05和54.16μM。3、JC-1染色结果显示,25、50μM浓度Rh2作用143B和MG63细胞24h后,细胞内绿色荧光含量相对增多,且荧光强度正比于Rh2浓度;空白对照组内细胞基本全部呈现红色荧光。4、划痕愈合试验显示,非细胞杀伤浓度Rh2组143B细胞6、12h相对迁移距离较空白组缩短,同时MG63细胞12、24h细胞相对迁移距离亦短于空白组;Transwell实验表明,Rh2处理后143B和MG63细胞穿膜数量明显减少,相对于空白组均有统计学意义(P<0.05)。5、蛋白水平检测发现Rh2作用的143B和MG63细胞(25、50μM)较空白组凋亡相关分子c-Caspase-3/8/9/PARP灰度值更深,增殖分子PCNA灰度值随浓度增加而减弱,信号通路P38蛋白条带在各组中基本一致,p-P38随Rh2浓度增加而加深。6、Limma统计结果显示,以log|FC|>1,P<0.05为标准检出原发性肿瘤组与骨肉瘤肺转移组间差异基因共计913个,GSEA富集证实原发肿瘤显著异常通路为Alzheimer’s disease和Huntington disease(FDR<0.25,P<0.01),而Chemokine pathway在转移组被显著富集(ES=0.42,P<0.05);基于样本分组的PCA在PC1上分布变异度为35.6%,两组样本以0轴为界左右分布,在PC2上为12.5%,组内大部分样本集中于某一区域。结论1、人参皂苷Rh2可结构特异地作用于细胞生物分子,并可能通过网络作用干预骨肉瘤进程。2、人参皂苷Rh2具有抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移,促进早期凋亡作用。3、人参皂苷Rh2抑制骨肉瘤增殖、迁移,促细胞早期凋亡可能是通过激活P38/p-P38途径发挥作用。4、临床骨肉瘤组间进展涉及迥异的信号通路激活,依托分子差异表达及功能富集可辅助骨肉瘤亚型鉴别,实现个体精准治疗。