【摘 要】
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急性髓系白血病(AML)是一种具有多种遗传异常和治疗反应性的异质性疾病。目前,AML的发病率和死亡率逐年增加,并受到了广泛的关注。AML的治疗手段单一,化学治疗仍然是目前主要治疗手段,然而化疗患者存在愈后不良、复发率高等问题。多药耐药是造成AML化疗失败的最重要的原因之一,而多药耐药相关基因-1(MDR1)基因的异常表达是导致多药耐药的主要原因。MDR1的转录和翻译的监测对AML早期多药耐药及愈后
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急性髓系白血病(AML)是一种具有多种遗传异常和治疗反应性的异质性疾病。目前,AML的发病率和死亡率逐年增加,并受到了广泛的关注。AML的治疗手段单一,化学治疗仍然是目前主要治疗手段,然而化疗患者存在愈后不良、复发率高等问题。多药耐药是造成AML化疗失败的最重要的原因之一,而多药耐药相关基因-1(MDR1)基因的异常表达是导致多药耐药的主要原因。MDR1的转录和翻译的监测对AML早期多药耐药及愈后监测具有重要意义,然而对MDR1的相关监测缺乏有效、快速的手段,现有手段(核酸分子杂交和聚合酶链反应等)存在耗时长、消耗高、易出现假阳性结果等问题。因此研究一种简便快速、高灵敏度的MDR1基因监测的新手段对AML的早期治疗及愈后监测具有重要意义。在本研究中,将纳米技术和酶生物技术相结合,构建了三种新型的电化学生物传感器对MDR1基因进行检测并取得了良好的效果。dsDNA(双链DNA)电化学传感器构建简便、检测快速,能够实现对MDR1基因的快速定性、较高浓度下的定量检测;POD(辣根过氧化酶)三明治结构电化学传感器具有高特异性、高稳定性和较高的灵敏度,能够对MDR1基因进行快速定量检测;AuNPs-POD电化学传感器在电极表面构建了四重结构,实现对MDR1基因的多重识别,具有极高的灵敏度和高特异性,能够实现MDR1基因的快速、高灵敏度、高选择性检测。传感体系中加入金纳米粒子(AuNPs)能够有效地放大电化学信号,提高电信号的传导效率;此外,通过将POD修饰在金电极表面也能够有效地放大信号,缩短检测时间。这个传感体系包括捕获探针、靶标序列、报告序列、金胶序列等。利用多种电化学方法:循环伏安法、时间电流曲线法、阻抗法等,对电极表面特征进行表征,对电信号进行检测,并对检测结果进行实时分析。针对不同检测体系的特异性、线性、灵敏度、重复性指标进行了方法学验证后发现:在dsDNA电化学传感体系中,MDR1基因在0.1 nM-10 nM的浓度范围下检测呈现出良好的线性,检测限达到0.1 nM,能够有效识别靶标序列,呈现出较为优良的特异性,适用于较高浓度下MDR1基因的快速定性与定量检测;在POD-TMB电化学传感体系中,MDR1基因在0.05nM-7.5nM的浓度范围下检测呈现出良好的线性,检测限为0.0018 nM,说明POD催化反应可以有效放大信号,该传感器适用于低浓度下MDR1基因的定性与定量检测;在AuNPs-POD电化学传感体系中,AuNPs的加入显著降低了空白背景值,使得检测灵敏度大大提高,MDR1基因在1 fM-100pM的浓度范围下检测呈现出良好的线性,检测限为1.5e-4 fM,而且呈现出良好的特异性和选择性,能够有效识别出靶标序列,区分不同数量的碱基错配序列,能够对MDR1基因进行高灵敏度、高特异性的检测。本课题中的电化学传感体系包含三个特点鲜明的电化学传感器,分别适用于不同条件下的MDR1基因的检测,具有灵敏度高、特异性强、操作方便、检测速度快等优点。在AML多药耐药的早期检测中具有巨大的应用潜力,对产生多药耐药患者的诊断及个性化治疗具有重要意义。
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