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高密度脂蛋白（HDL）中含量最高的载脂蛋白为ApoA-Ⅰ蛋白,ApoA-Ⅰ蛋白可通过与肿瘤细胞膜表面的SR-BI受体结合,引导高密度脂蛋白向肿瘤细胞输送胆固醇。现已报道的ApoA-Ⅰ模拟肽4F具有与ApoA-Ⅰ蛋白相似的生物学功能,且被证实具有抗肿瘤作用。研究发现HDL受体SR-BI不仅在多种肿瘤细胞上高表达,而在正常的肝脏、乳腺和前列腺部位的表达量也较高,利用ApoA-Ⅰ的靶向特性给药有可能会导致脱靶现象,并且造成肝脏等器官损伤。因此本研究针对肿瘤微环境低p H、高活性氧（ROS）的特点,结合4F模拟肽的结构特征设计了一系列肿瘤微环境刺激响应型模拟肽,并利用分子动力学模拟技术进行筛选,得到多条具有构象刺激响应能力的模拟肽,在体外细胞和体内动物模型上进行实验验证。全文共分为如下五部分:1.综述本章主要围绕生物大分子的肿瘤靶向递送和ApoA-Ⅰ模拟肽的研究进展,以及分子动力学模拟技术的应用进行了多方面综述。首先阐述了生物活性大分子在肿瘤靶向递送过程中面临的多级生物屏障,以及针对性的靶向递送策略;随后回顾了ApoA-Ⅰ模拟肽的研究进展,包括模拟肽的设计开发过程,现有模拟肽及其生物学功能;最后阐述了分子动力学模拟技术的研究进展,包括简要概述、基本过程、常用力场等相关内容及其在医药学方面的应用,为本研究提供了理论支持。2.基于分子动力学模拟技术的刺激响应型ApoA-Ⅰ模拟肽的设计及筛选本章旨在设计一种刺激响应型ApoA-Ⅰ模拟肽,在肿瘤微环境条件下发挥出作用。研究表明ApoA-Ⅰ蛋白的生物活性是由其A型两亲性α螺旋二级结构这种特定的构象所决定的,而通过模拟A型两亲性α螺旋的构象,模拟肽也能表现出类似的ApoA-Ⅰ蛋白活性,甚至效果更佳。故本研究针对肿瘤微环境低p H、高ROS的刺激条件,设计了一种刺激响应型氨基酸衍生物来控制模拟肽的构象转变,同时考虑到侧链长度的影响,设计了两种特殊氨基酸衍生物,随后参照模拟肽4F的序列特征,在保持亲水-疏水界面的同时有选择的替换疏水氨基酸残基,设计出一系列模拟肽。随后利用分子动力学模拟技术进行模拟肽的筛选。首先围绕所设计的刺激响应型氨基酸衍生物,根据不同环境下氨基酸残基的质子化状态构建相应的力场文件。然后构建具有α螺旋构象的多肽的pdb文件,对模拟肽进行牵引模拟,筛选出呈现无规则状态的构象文件。对其进行60ns的分子动力学模拟后,计算RMSD值发现多肽的构象变化趋向于稳定状态;并利用dssp程序检测模拟肽在不同环境下的螺旋含量,筛选得到具有良好变构能力的模拟肽5-A,其在肿瘤模拟环境下的α螺旋度为71.56%,而在正常模拟环境下20ns后平均螺旋度只有18.37%,其构象具有良好的刺激响应性。3.刺激响应型ApoA-Ⅰ模拟肽的构建本章首先规划了氨基酸衍生物的合成路线,在合成后确认了化合物的结构。随后利用固相合成方法合成了所设计的基础多肽,并且运用巯基-烯烃点击化学反应合成了模拟肽5-A、2-A和4-A,以及利用高效液相色谱（HPLC）和基质辅助激光解吸串联飞行时间质谱（MALDI-TOF）鉴定了制备的多肽产物。4.刺激响应型ApoA-Ⅰ模拟肽的体外活性研究本章通过氨基酸衍生物的刺激响应性实验、ApoA-Ⅰ活性模拟实验及细胞毒性实验考察了利用分子动力学模拟进行筛选的有效性,以及模拟肽的肿瘤微环境响应能力和抗肿瘤增殖能力。首先体外模拟肿瘤微环境的条件,利用荧光分光光度计和高效液相色谱检测了模拟肽的刺激响应能力,结果表明合成的氨基酸衍生物在模拟肿瘤微环境条件下会较为迅速地改变其物理化学性质,具有较强的刺激响应性。随后制备包裹罗丹明B的脂质体用来模拟肿瘤细胞膜,考察模拟肽在不同环境下对肿瘤细胞膜的作用。结果显示在正常生理条件下,罗丹明B在24h内的释放率稳定在13.5%左右;而在模拟肿瘤微环境下,罗丹明B在24h内的释放率高达83%,说明所设计的模拟肽具有刺激响应性,且对肿瘤细胞膜具有较强的破坏作用,能够模拟ApoA-Ⅰ蛋白的生物活性。最后通过细胞毒性实验考察了模拟肽的抗肿瘤能力,结果表明在正常生理环境下,模拟肽不具有细胞毒性;而在弱酸性条件下,模拟肽在两种细胞系上均表现出不同程度的杀伤作用,其中5-A效果最好,2-A次之,4-A最差(5-A的IC50为2.446μg/m L;2-A的IC50为3.686μg/m L;4-A的IC50为7.930μg/m L)。细胞毒性结果与动力学模拟的数据相一致,且5-A的抗肿瘤效果远远好于阳性对照4F,表明所设计的模拟肽具有较灵敏的刺激响应性和较好的抗肿瘤作用。5.刺激响应型ApoA-Ⅰ模拟肽的体内靶向抗肿瘤活性研究本章构建了4T1荷瘤小鼠模型,以考察模拟肽5-A的体内靶向抗肿瘤活性。结果表明5-A高剂量组小鼠肿瘤体积显著小于生理盐水组（p<0.0001）,且小于阳性对照4F高剂量组和5-FU组,远小于阳性对照4F低剂量组（p<0.0001）。5-A（6mg/kg）组的抑瘤率为71.43%,4F（15mg/kg）组的抑瘤率为57.14%,4F（5mg/kg）组的抑瘤率为28.57%,5-FU（25mg/kg）组的抑瘤率为60.57%,证实相比阳性对照4F,模拟肽5-A具有更强的体内抗肿瘤作用。活体成像结果表明5-A组药物24h时基本蓄积于肿瘤部位,在肝肾部位也有少量蓄积;而4F组药物在心肝脾肺肾及肿瘤部位均有广泛的分布,从而证明本研究设计的刺激响应型模拟肽5-A具有更加良好的肿瘤靶向能力。综上所述,本论文设计和筛选得到了一种新型的刺激响应型模拟肽,对于肿瘤微环境的刺激条件具有优良的响应能力。并且通过体外细胞和体内动物模型,证实了模拟肽能够模拟ApoA-Ⅰ蛋白的活性,同时具有灵敏的刺激响应性和显著的抗肿瘤作用。也证实了通过分子动力学模拟方法进行筛选和优化的可靠性,以期为生物大分子类药物的肿瘤靶向递送提供一种借鉴和参考。