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生物是自然界的重要组成部分。虽然,不同的生物拥有不同的结构性状和功能,但其组成生命的基本单元却是相同的。因此,从某种意义上来说,它们或许有着相似甚至相同的基本规律。遵循着科学研究的基本发展模式,我们选取了结构较为简单的单细胞原核细菌——大肠杆菌作为研究对象。大肠杆菌结构简单,易于获取,培养方便,繁殖迅速等特点是其备受科研工作者喜爱的原因。不同于物体在宏观尺度的行为,只有微米量级尺寸的大肠杆菌就像一个精细的小机器,它在微米的尺度完成生物的一些基本功能,如趋化适应等。 本论文先后使用乳胶小球标记和荧光共振能量转移等技术手段,分别观察和记录了大肠杆菌鞭毛马达和内部趋化信号蛋白输出的适应信号。使用信号处理的基本方法,运用简单的数学物理模型,解释各种条件导致的适应信号差异。并结合实验与模拟,阐述了信号差异对大肠杆菌趋化行为的影响。下面,我们简单介绍下各章所述的主要内容。 论文的绪论部分主要介绍了大肠杆菌的基本情况及其相关的研究进展。我们从大肠杆菌的形态与结构说起,依次介绍了其遗传增殖和致病性情况。重点介绍了大肠杆菌研究的两大重点内容——运动性和趋化性。对于运动性的说明,我们首先介绍了各个运动部件的结构与组成,包括嵌入细胞三层壁的鞭毛马达,作为传动部件的鞭毛钩以及运动的终端输出鞭毛丝。其中,最为主要的是运动的源头——鞭毛马达。其次,我们简要地说明了单个大肠杆菌在液体环境下的游动行为以及大量菌体在凝胶表面的群集运动行为,并简单介绍了大肠杆菌群集运动的结果——生物膜的形成。而对于大肠杆菌的趋化性介绍,我们首先从大肠杆菌的受体开始介绍,完整地描述了趋化信号网络通路。紧接着概述了大肠杆菌趋化网络和鞭毛马达的MWC和伊辛这两种主流模型。绪论部分的最后,我们概括地阐述了本论文研究的意义及主要内容。 论文的第二章主要是实验方法简单介绍。该章的起始,我们首先简要地介绍了各种试剂的配置方法及用途。紧接着我们将改造菌种时所用的DNA重组方法进行简短的原理与步骤说明。其中,主要包括热击法转化,电穿孔转化,聚合酶链式反应以及λ噬菌体Red重组系统基因删除。 论文的第三章主要是探究生长条件对大肠杆菌趋化行为的影响。我们分别测量了营养贫乏与丰富的两种培养液(H1和TB)下生长的大肠杆菌的生长曲线,选择合适的采样区间。比较了两种细菌的CW bias分布,无刺激环境下的马达关联时间,50μM MeAsp的响应恢复时间以及毛细管实验的聚集情况。实验发现,两种细菌的CW bias分布基本相同,关联时间和恢复时间均表现出较大的差别。生长于H1溶液中的细菌表现出更短的关联时间与恢复时间,分别是TB细菌1.65和1.36倍。最后,我们分别通过毛细管实验和数值模拟证明了在H1中生长的大肠杆菌对于刺激浓度具有更强的局域行为,能更快的响应浓度变化,完成趋化。 论文的第四章主要是探究受体协同作用对其趋化行为的影响。我们使用小球标记和FRET技术,先后测量了单种受体菌株和野生型菌株的台阶响应信号,剂量响应曲线。并且,改变Tar和Tsr受体比例观察其台阶响应的差别。最后,利用简单的swim plate实验比较了两种细菌的趋化能力。结果发现,在MeAsp浓度为5μM至250μM时,单种受体菌株表现出明显的不完全适应行为,而野生型菌株则几乎可以完成精确适应。在比较适应稳态活性和适应时间时,我们发现单种受体的适应活性与适应时间随刺激浓度的变化明显,而野生型菌株的变化相对小得多。我们在比较两种细菌的剂量响应曲线后,得到单种受体菌株的MWC簇中总受体数约为11.7,而野生型则为19.5。我们通过模拟得到单种受体细菌的甲基化速率约为野生型的0.56倍,这应该与受体簇的差别有关。除此之外,我们还研究了受体比例对过冲行为的影响。最后,通过swim plate实验证实了单种受体细菌趋化能力更差。 论文的第五章主要是对鞭毛马达适应性重组进行建模。细菌趋化是研究信号转导的典型系统。其最具代表性的特点就是适应行为的鲁棒性。但是,这样一个系统的适应过程究竟有多快仍具有争议性。从细胞内酶活性测量结果来看,适应时间大约有几十秒;而从鞭毛马达的水平进行测量的结果却不足十秒。最近的研究表明,鞭毛马达展现出适应性的重组,其主要生理作用是在受体的输出与马达的输入之间提供一种强力的匹配。普遍认为其适应非常缓慢,以致于无法为整个趋化系统的适应提供较为明显的贡献。本文通过对马达适应性重组的理论建模和实验测量,说明由马达适应导致的部分适应能够显著地加快系统的适应,从而解决了之前关于适应时间的争议。 论文的第六章主要是对三项核心工作的总结与展望。第一项工作主要是结合小球标记马达等实验与计算机模拟得出生长于H1中的大肠杆菌具有更强的适应能力。第二项工作主要是通过小球标记和FRET实验研究受体协同作用对大肠杆菌趋化的影响。我们发现单种受体的细菌表现出更差的适应精度,但却可以表现出与野生型相似的过冲行为。第三项工作主要是对马达适应性重组的建模。通过实验检验的模型成功地解释了之前关于适应时间测量结果的争议。而展望部分主要对文章中仍未解决的问题进行进一步的思考。如单种受体细菌部分适应行为的解释以及马达适应性重组模型的进一步完善等。