目的:人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）感染人体后会导致CD4+T淋巴细胞数目进行性减少,最终引发获得性免疫缺陷综合征（Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）。持续的抗逆转录病毒治疗（Anti-retroviral therapy,ART）可以抑制HIV感染者体内的病毒复制,使患者的CD4+T细胞数目增加,CD4+T细胞大于500cells/μl者被称为免疫应答者（Immunological responders,IR）,但仍有小部分患者的CD4+T细胞水平无法得到有效恢复,CD4+T细胞小于350cells/μl,被称为免疫无应答者（Immunological non-responders,INR）。INR 患者由于CD4+T细胞恢复不良,无法获得足够的免疫重建,机体处于持续的慢性免疫活化状态,合并机会性感染的风险更高。目前能够有效促进INR免疫重建的干预措施十分有限,因此急需深入研究INR患者免疫功能无法得到充分恢复的原因,寻找能够促进INR免疫恢复的新的干预措施,这是目前HIV研究领域亟待解决的问题。CD4+T细胞的生长发育及生理功能与其代谢活性息息相关,而HIV感染CD4+T细胞后也伴随其代谢活性的变化。然而,目前与INR患者CD4+T细胞代谢相关的研究甚少,特别是线粒体功能及糖代谢相关调节因子还未见研究。本论文研究了 INR及IR患者CD4+T细胞的营养物质转运体表达、糖摄取能力及糖代谢相关调节因子水平;进一步研究了 CD4+T细胞线粒体功能及细胞增殖和细胞因子分泌等功能,为探究促进INR免疫重建的干预措施提供了实验室数据参考。研究方法:1、密度梯度离心提取外周血单个核细胞（PBMCs）。2、CD4+T细胞表面标志物检测:将提取的PBMCs分别进行表面染色,4℃避光孵育30分钟,2%FBS洗液清洗细胞后离心,弃上清,200ul PBS重悬细胞后用BD Canto Ⅱ流式细胞仪检测。3、CD4+T细胞核内标志物检测:将提取的PBMCs重悬为1ml体系,每管加入1 μl LIVE/DEAD进行死活染色,4℃避光孵育30min,洗一遍细胞后再进行表面染色,最后用Thermo Fisher公司的破核试剂进行破核,再分别进行核内标志物的染色,4℃避光孵育30min,破核洗液清洗细胞,重悬后上机检测。4、CD4+T细胞内磷酸化标志物检测:将提取的PBMCs重悬为1ml体系,每管加入1μlLIVE/DEAD进行死活染色,4℃避光孵育30min,洗一遍细胞后再进行表面染色,最后用BD公司的磷酸化试剂处理细胞后,加入p-mTOR染料,4℃避光孵育30min,2%FBS溶液清洗细胞,重悬后上机检测。5、CD4+T细胞负选:提取研究对象的PBMCs,用Stem Cell公司的CD4+T细胞富集试剂盒阴性选择所需的CD4+T细胞。6、CD4+T细胞迁移能力检测:将负选得到的CD4+T细胞用RPMI1640重悬为0.5 Million/100μl,取100μl细胞悬液轻轻加入5.0μm-Transwell板上室,下室加入600μ1趋化因子SDF-1（100ng/ml）,置于37℃温箱孵育3小时后,计数下室的细胞数。7、CD4+T细胞增殖能力检测:取0.5 Million负选的CD4+T细胞用PBS重悬为1ml,加入1μlCell Trace Violet染料,37℃避光孵育30min,清洗细胞并弃净上清后加入200μl R10重悬细胞,将细胞转移至96孔板中并加入CD3/CD28 beads（与细胞数1:1加入）刺激细胞,置于37℃温箱培养,第三天时给细胞换液后继续培养至第五天,收集细胞后用7-AAD染色,5分钟内上机检测。8、CD4+T细胞分泌细胞因子能力检测:将负选的CD4+T细胞用R10重悬为0.5 Million/200μl,然后将细胞转移至96孔板（每孔200μl）,同时加入CD3/CD28 beads刺激物和CD107a-PE染料,轻柔混匀后置于37℃温箱中培养24小时,培养结束前6小时加入Golgistop。收集细胞后加入LIVE/DEAD染色,4℃避光孵育30分钟,然后进行表面染色（CD4-APC-Cy7）,4℃避光孵育30分钟,再用破膜剂4℃避光孵育20分钟使细胞破膜,破膜洗液清洗细胞,再加入IL-2-APC、TNFα-PE-Cy7染色,4℃避光孵育30分钟,破膜洗液洗细胞后上机检测。9、CD4+T细胞糖摄取功能检测:将PBMCs用无糖R10培养基重悬为1ml,加入2-NBDG（100μM）混匀,37℃避光孵育30分钟,洗两遍细胞后进行表面染色（CD3-PE-Cy7、CD4-APC-Cy7）,最后加入7-AAD染死活,5分钟内上机检测。10、CD4+T细胞线粒体功能及ROS水平检测:将PBMCs用预热至37℃的PBS重悬为 1ml,分别加入 MM（12.5nM）、MMP（12.5nM）、ROS（1.25μM）染料混匀,37℃避光孵育30分钟,洗两遍细胞后进行表面染色（CD3-PE-Cy7、CD4-APC-Cy7）,最后加入7-AAD染死活,5分钟内上机检测。结果:1、INR患者CD4+T细胞上CD71表达明显高于IR。Glut1、CD98的表达在三组人群间均无明显差异（图1A-D）。IR组CD4+T细胞CD36表达明显高于NC组（P<0.01,图1E、F）。而INR组CD4+T细胞上CD71的表达水平（%及MFI）明显高于NC、IR两组（P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.01,图 1G-J）。2、HIV感染者CD4+T细胞上CD71的表达水平与CD4+T细胞数目呈明显负相关。CD71的百分比及MFI与感染者CD4+T细胞数目呈明显负相关（r=-0.6285、r=-0.4891,图 2A、B）。3、INR患者CD4+T细胞糖代谢水平与NC组有明显差异。IR、INR两组的CD4+T细胞中2-NBDG的MFI均明显高于NC组（P<0.01、P<0.01）,但IR组与INR组之间无明显差异（图3A、B）。INR组CD4+T细胞中p-mTOR的水平（MFI）明显低于NC组（P<0.01）,但IR组与NC组之间无明显差异（图3C、D）。IR、INR两组的CD4+T细胞中HIF-1α的表达水平（MFI）均显著高于NC组（P<0.01、P<0.01）,但在IR组与INR组间无明显差异（图3E、F）;c-Myc的表达水平（MFI）在NC、IR、INR三组间无明显差异（图3G、H）。4、INR患者CD4+T细胞中ROS的水平明显高于IR。CD4+T细胞中MM表达水平在NC、IR、INR三组人群之间无明显差异（图4A、B）,而IR、INR两组患者CD4+T细胞中MMP的表达水平明显高于NC组（P<0.01、P<0.01）,但在IR、INR两组间同样无明显差异（图4C、D）。而INR组CD4+T细胞胞浆中ROS水平（%及MFI）明显高于NC、IR两组（P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.01,图 4E-H）。5、HIV感染者CD4+T细胞中ROS的水平与CD4+T细胞数目呈明显负相关。CD4+T细胞中ROS的水平（%及MFI）均与感染者CD4+T细胞数目呈明显负相关（r=-0.7607、r=-0.7250,图5A、B）。CD4+T细胞表面CD71的表达水平与其胞内ROS水平（%及MFI）均呈明显正相关（r=0.7619、r=0.9280,图5C、D）。6、INR患者CD4+T细胞增殖能力不低于IR。INR组CD4+T细胞死亡比例明显高于NC组（P<0.01）,但IR组与NC组无明显差异（图6A）。INR组CD4+T细胞中Ki-67的表达水平明显高于NC、IR两组（P<0.01、P<0.01）,且 IR 组也明显高于 NC 组（P<0.01,图 6B、C）,且 CD4+T细胞中Ki-67的表达水平与感染者CD4+T细胞数目呈明显负相关（r=-0.6937,图6D）。而三组人群的增殖传代能力并无明显差异（图6E、F）。7、INR患者CD4+T细胞活化、凋亡水平明显高于IR。INR患者CD4+T细胞活化（CD38+HLA-DR+）水平明显高于IR和NC两组（P<0.01、P<0.01,图 7A、B）。IR、INR 两组的 CD4+T 细胞衰老（CD57+）水平均明显高于NC组（P<0.01、P<0.01,图7C、D）。同时,INR患者CD4+T细胞早期凋亡（Annexin V+7-AAD-）和整体凋亡（Annexin V+）比例都明显高于IR、NC 两组（P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.01,图 7E、F）。HIV 感染者 CD4+T 细胞的活化（r=-0.5504,P<0.01）、凋亡（r=-0.3567,P=0.011）水平均与感染者的CD4+T细胞数目呈明显负相关（图7G、I）。8、INR患者CD4+T细胞分泌IL-2的能力明显降低。三组人群CD4+T细胞的迁移能力无明显差异（图8A）。CD4+T细胞脱颗粒水平（CD107a）及分泌TNF-α的水平在三组人群之间无明显差异（图8B-E）,而INR组的CD4+T细胞分泌IL-2的水平要明显低于NC组和IR组（P<0.01、P<0.01,图 8F、G）。结论:INR、IR患者CD4+T细胞的Glut1、CD98、CD36的表达水平无明显差异,但INR组CD71表达水平明显增高,且CD71水平与患者CD4+T细胞呈明显负相关;INR组CD4+T细胞糖代谢水平与NC组有明显差异;INR、IR两组CD4+T细胞的MMP水平明显高于NC组,INR组CD4+T细胞胞浆ROS水平明显增高,且ROS水平与患者CD4+T细胞呈明显负相关,同时CD4+T细胞的ROS水平与CD71水平呈明显正相关;INR患者CD4+T细胞的增殖能力不低于IR患者,但其活化、凋亡水平明显增高;且INR患者CD4+T细胞分泌IL-2水平明显降低;本论文为探究促进INR患者免疫重建的干预措施提供了实验室数据参考。