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端粒是真核生物线形染色体末端高度保守的重复核苷酸序列和蛋白质的复合体，由一段串联重复的富G（鸟嘌呤碱基）DNA序列和相关蛋白组成。端粒对于染色体的稳定非常重要。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，能利用自身RNA为膜板合成端粒DNA，弥补随着细胞有丝分裂逐渐缩短的端粒长度。大量研究证实，超过85％的恶性肿瘤细胞，其端粒酶活性高于正常组织。端粒、端粒调控蛋白与恶性肿瘤密切相关，但机理尚不清楚。 人端粒重复序列结合因子（Telomere Repeat Binding Factor TRF1）是最早发现的端粒调控蛋白，也是端粒调控蛋白中重要的组成部分。目前已明确TRF1全长为439个氨基酸，C端MybHTH区域是与端粒DNA结合的主要功能区。TRF1蛋白可特异地结合于端粒TTAGGG重复片断，MybHTH区域在进化中最保守。对其功能研究表明TRF1通过调节端粒长度而抑制端粒酶活性，被认为是端粒酶活性的负调控因子。Yamada等报道在急性白血病中TRF1和TRF2 mRNA的表达明显低于正常细胞。对TRF1蛋白质表达水平的研究仅见于Aragona等的两篇报道：2000年，Aragona等应用抗TRF1多克隆抗体对消化道肿瘤进行免疫组织化学染色，结果发现，TRF1的表达在恶性肿瘤中的表达明显低正常、炎症组织及良性肿瘤；2001年，其又运用相同方法对颅脑肿瘤进行了检测，也得到了相似的实验结果。但迄今为止，对TRF1蛋白质在组织中表达水平的定量分析及其与端粒酶活性关系的研究未见报道，也未见有关抗TRF1单克隆抗体的报道。 本研究在已获得的抗TRF133-277单克隆抗体基础上，对该单抗进行鉴定及生物学特性的 浙江人学硕士学位论文研究，并进一步应用该单抗对急性白血病和肾脏肿瘤中TRFI的蛋白质表达水平进行检测，目在探讨TRFI与恶性肿瘤的诊断、治疗与预后的关系，为今后TRFI检测技术应用于临床提供新的理论与实验依据。 1、抗m’‘－”’单克隆抗体鉴定及生物学特性初步研究 以巳ISA间接法测定抗体滴度，小鼠腹水中单抗滴度为1。3200；取杂交瘤细胞株培养上消确定抗TRFI””“单克隆抗体属IgGI亚类。以抗TRFin”’单抗作Festern－blot检测，纯化TRFI i白质在约60KD处有一特异性条带，而纯化GST样本孔显示阴性结果，条带位置与TRFI计算分于量基本一致。对正常骨髓、急性白血病骨髓、大肠癌组织及近旁止常粘膜组织作Western－blot检测，也在约60KD处有一特异性条带，与阳性对照纯化TRFI蛋白相一致，说明表明抗TRFin－”’单抗仅针对TRFI蛋白，具有高度的特异性。以抗TRFln‘”单克隆抗体作免疫组化检测表明，大肠正常粘膜组织上皮细胞、正常及急性白血病骨髓细胞、大肠癌组织细胞的胞浆均有阳性表达，部分肿瘤细胞胞浆无着色，细胞核和组织间质呈阴性反应。 2、TRFI蛋自质在急性白血病中的表达水平及其与端粒酶活性关系的研究 以系列稀释的 TRF纯化蛋白作为相对定量标准，建立了以抗 TRFin－‘”单抗作定量Western－blot的方法。本研究的实验将TRFI纯化蛋白和组织蛋白以同样的方法定量，并同时以相同的条件作SDS－PAGE和免疫印迹，排除了其他因素对结果的影响。研究中的定量标准曲线是根据倍比稀释的纯化TRFI蛋白的Western－blot条带密度积分值与其对应含量建立的，条带密度积分值与信号分子含量之间的关系经统计分析符合线性关系，通过此标准曲线将组织样本的密度积分值转化为蛋白含量的相对值，样本之间的TRFI蛋白表达水平有直接的可比性。并且在每次实验时均设一组定量标准作标准曲线，减少了组间误差，使结果更可靠，可比性更强。 留取门例正常骨髓、20例急性白血病骨髓，分离出单个核细胞，提取总蛋白测定组织中TRrl蛋白质表达水平，结果表明TRn蛋白质在急性白血病（口．兀4土0．343 u g／yi）和正常骨髓组织中（2．217士0．461u g／＂l）均有表达，但在急性白血病骨髓组织中表达显著降低（P＜0，01）。急性淋巴细胞性白血病（ALL）患者的TRFI表达水平较急性非淋巴细胞性白血病（ANLL）患者略低，分别为 0．628士 0．284 u g／ul和 0．844土 0．360 u g／ul，但差异无统计学意义（Ptoo．05）。化疗缓解的患者化疗后TRFI表达水平与初发时相比明显 ～2～ 浙江大学硕士学位论文增高（0．772士0．307fig／111 VS．683士0．344fig／PI；p＜0．01），但仍低T正常（2．217士0．461uP／ul；P＜001），未缓解的患者治疗前后TRFI表达无明显差异（0．726上0．413fig／111 VS 0．894士0．338fig／ill；P＞0．05）。化疗未缓解患者TRFI表达水平（0．894士0、338 u g／ul）较化疗缓解的患者门．683士0．344 u g／ul)显著降低，差异具有显著性意义（p（0．of）。 同时对所有样本进行端粒酶活性检测，结果表明与正常骨髓组织相比急性白血病骨髓组织中端粒酶活性高表达 仇125士0．078 VS 0口765士0．284；p＜0．01）。ALL患者与 ANLL患者端粒酶活性差异无统计学意义