【摘 要】
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目的:构建M23-AQP4稳定表达HEK293细胞,并以此细胞为底物,采用细胞间接免疫荧光法(CBA)检测血清标本抗AQP4抗体。观察不同温度保存对M23-AQP4稳定表达HEK293细胞和血清标本抗
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目的:构建M23-AQP4稳定表达HEK293细胞,并以此细胞为底物,采用细胞间接免疫荧光法(CBA)检测血清标本抗AQP4抗体。观察不同温度保存对M23-AQP4稳定表达HEK293细胞和血清标本抗AQP4抗体的影响,探索一种简便易行的血清抗AQP4抗体检测方法,以利于血清抗AQP4抗体检测的临床推广。方法:将pEGFP-N1-M23-AQP4质粒通过磷酸钙转染试剂转染接种于6孔细胞培养板的HEK293细胞,在荧光显微镜下观察并选择瞬时转染率高的细胞培养孔,用含G418的筛选培养液筛选并挑单克隆细胞进行培养扩增,获得绿色荧光稳定表达的单克隆细胞,并以此细胞为底物,采用CBA法检测M23-AQP4表达及分布,以鉴定获得绿色荧光稳定表达的单克隆细胞是否为M23-AQP4稳定表达细胞。经鉴定M23-AQP4稳定表达HEK293细胞构建成功后,以其作为底物,采用CBA法检测7例视神经脊髓炎(NMO)、24例多发性硬化(MS)、41例其他脱髓鞘性疾病(视神经炎、脊髓炎、脱髓鞘性脑病、吉兰-巴雷综合征)以及30例非脱髓鞘性疾病患者血清抗AQP4抗体及其滴度,并比较4组患者血清抗AQP4抗体阳性率。M23-AQP4稳定表达HEK293细胞接种于96孔细胞培养板并经4%多聚甲醛固定,于室温、4℃、-20℃4周保存,并分别作为底物再次检测经首次检测为抗AQP4抗体阳性的血清标本及随机选取的相等数量的阴性血清标本的抗AQP4抗体及滴度,并比较其抗AQP4抗体阳性率和抗体滴度与首次检测结果是否存在差异。经首次检测为抗AQP4抗体阳性的血清标本及随机选取的相等数量的抗AQP4抗体阴性血清标本反复冻融3次后于室温、4℃、-20℃1周保存,以新鲜制备的M23-AQP4稳定表达HEK293细胞为底物,采用CBA法分别检测上述血清标本抗AQP4抗体及其滴度,并比较其检测结果与首次检测结果是否存在差异。结果:经CBA法检测鉴定表明绿色荧光稳定表达的单克隆细胞即为M23-AQP4稳定表达细胞,M23-AQP4稳定表达HEK293细胞构建成功,检测显示M23-AQP4主要表达在细胞膜上。本研究基于M23-AQP4稳定表达HEK293细胞的CBA法检测血清抗AQP4抗体,结果显示NMO阳性率达85.7%(6/7),显著高于多发性硬化(MS)4.2%(1/24)及其他脱髓鞘性疾病2.4%(1/41)和非脱髓鞘性疾病0.0%(0/30)(均P<0.01),其诊断NMO的敏感性为85.7%(6/7),以MS作为对照时,其诊断NMO的特异性为95.8%(23/24),以非NMO的脱髓鞘疾病作为对照时,其诊断NMO的特异性为96.9%(63/65),以非脱髓鞘疾病作为对照时,其诊断NMO的特异性为100%(30/30)。M23-AQP4稳定表达HEK293细胞于室温、4℃、-20℃三种温度保存4周后分别用于血清标本抗AQP4抗体检测,其抗AQP4抗体检出率和抗AQP4抗体滴度值与首次检测结果一致。血清标本于室温、4℃、-20℃三种温度保存1周后,采用以新鲜制备的M23-AQP4稳定表达HEK293细胞为底物的CBA法分别进行抗AQP4抗体检测,结果显示4℃以下保存的血清标本其抗AQP4抗体检出率和抗体滴度值与首次检测结果一致;室温条件下保存的血清标本其抗AQP4抗体检出率与首次检测一致,但抗AQP4抗体滴度值显著低于首次检测所得的抗体滴度值(P<0.01)。结论:成功构建M23-AQP4稳定表达HEK293细胞。NMO患者血清中广泛存抗AQP4抗体,抗AQP4抗体可作为NMO的可靠生物学标志。本研究方法检测抗AQP4抗体对NMO的敏感性和特异性较高,可用于辅助NMO的临床诊断及鉴别。M23-AQP4稳定表达HEK293细胞和血清抗AQP4抗体稳定性较好,本研究方法简便易行,有助于抗AQP4抗体检测的临床推广。
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