人体微生物与人类健康密切相关,平衡的微生态系统对维持人体健康有举足轻重的作用,而微生态失衡可能导致疾病的发生发展。同时疾病状态会对人体微生物特定功能类群的结构和组成产生影响,导致微生物群落结构和多样性的改变。肝癌是严重威胁人类生命健康的疾病,因此,研究肝癌患者的微生物群落特征,寻找肝癌患者微生物群落中的关键类群,探索其促进肝癌发生发展的机制,评估其用于临床诊断与治疗的潜力,对早期诊断、治疗肝癌患者,挽救患者生命具有重要作用。本研究采用分子生态学的理论与方法,对符合入组标准的乙肝肝硬化、肝癌患者及其健康一级亲属的粪便和血液细菌群落的构成、多样性、关键类群,及其与临床生理参数的相关性进行系统研究。旨在阐明肝癌患者人体微生境中细菌群落的构建机制,厘清血液与肠道细菌群落组成的关系,探究血液微生物的来源,为肝癌的早期诊断提供可靠的生物标志物。具体研究结果如下:(1)原发性肝癌患者肠道细菌群落特征聚类分析及三元相图分析表明,肝癌患者肠道细菌群落结构在科、属水平发生显著改变。AFPH组较AFPL组的肠道细菌α多样性发生显著改变(P<0.05)。说明疾病会对人体细菌群落结构产生影响,但肝癌患者中AFP的高低导致的肠道细菌群落结构及多样性变化并不相同。Metastats、LEf Se及随机森林分析筛选出Romboutsia、韦荣球菌属(Veillonella)两个差异类群。ROC曲线分析发现,Romboutsia、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、Romboutsia与韦荣球菌属两者联合、以及梭杆菌属(Fusobacterium)、粪杆菌属(Faecalibacterium)和消化链球菌科三者联合对肝癌的诊断价值较高。RDA、Spearman方法分析表明,肝癌患者与健康人的差异类群与人体多种生理指标有显著相关性(P<0.05)。通过分子生态网络的构建进一步明确了厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)是肝癌患者肠道细菌群落的关键细菌类群。(2)原发性肝癌患者血液细菌的群落结构特征通过聚类分析及三元相图分析,肝癌患者血液细菌群落组成在科、属、种水平发生显著改变。Konellia、Thermomonas、Romboutsia、韦荣球菌属是肝癌患者血液细菌群落的关键差异类群。对差异类群行ROC曲线分析,发现肠道细菌与血液细菌群落中的差异类群联合分析明显提高诊断准确率。值得注意的是,AFPL患者中厚壁菌门诊断HCC准确率高达0.939,有望为疑诊HCC的AFPL患者的诊断提供理论依据。通过RDA、Spearman方法分析HCC患者血液细菌与人体生理指标的相关性,发现关键差异类群与多种生理指标显著相关(P<0.05),可能参与疾病病理生理过程及肝癌的发生。明确厚壁菌门、变形菌门是肝癌患者血液细菌群落的关键类群,肝癌患者的关键类群较健康群体减少,AFPH患者的血液细菌中未能找到关键类群,说明肝癌患者中AFP增高的群体中细菌群落结构稳定性下降。(3)肠道和血液细菌群落的关系分析Venn图研究显示不论是健康还是疾病状态,在肠道和血液中绝大多数细菌是共有菌,仅小部分为各自特有菌。因此我们推测肝癌患者中的血液细菌大部分可能通过肠肝轴来源于肠道。肝癌患者特有的血液细菌明显增多,说明这些增多的血液细菌可能与肝癌发生发展有关。通过对肝癌患者及健康人群的细菌群落多样性进行相关性分析,发现健康人群肠道与血液细菌的α多样性呈一定负反馈关系,而肝癌患者肠道与血液微生物的α多样性无显著相关。使用聚类图及柱状图结合、Heatmap及配对样品Wilcoxon符号秩检验对家庭中微生物相似性进行研究,结果发现家庭中患者及健康人肠道和血液细菌在属水平总体具有相似性。这可能是由共同的遗传因素、地理环境、生活习惯及饮食结构所致。(4)微生物失衡促进肝癌进展可能的机制研究表明,失调的肠道微生物激活m TOR,导致肝癌发生。本研究采用q RT-PCR和Western blot检测沉默m TOR后肝癌细胞SNRPA1 m RNA和蛋白质表达,结果表明激活m TOR后SNRPA1 m RNA和蛋白表达增加(P<0.05)。通过敲减肝癌细胞的SNRPA1基因,研究SNRPA1在裸鼠体内的成瘤性及在体外对HCC细胞的增殖的影响,结果表明SNRPA1基因可以在体内致瘤,并促进肝癌细胞的增殖。因此推测,失调的肠道微生物可能通过激活m TOR,使SNRPA1表达增加,促进肝癌的发生发展。综上所述,肝癌患者中肠道及血液细菌类群结构在科、属、种水平发生显著改变。患者体内的生理指标与细菌群落结构显著相关,细菌群落的关键差异类群单独或与联合可能为肝癌非侵入性诊断提供理论依据,研究结果具有重要的应用价值。