平菇转漆酶基因工程菌株的构建

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我国每年仅农业生产中形成的农作物残渣(麦秸、玉米秸秆)众多,其富含木质纤维素。应用食用菌转化秸秆、变废为宝是一条可行的途径。为提高食用菌利用木质纤维素的能力,提高食用菌对秸秆的生物学效率,本文以平菇天达300为材料,构建了高效遗传表达载体,并进行了漆酶基因转化。研究结果如下:1.平菇POXC漆酶基因在毕赤酵母中的表达。将编码漆酶成熟蛋白的cDNA构建到pPIC9K上,利用酿酒酵母α-factor作为信号肽,用电转化的方法,转入毕赤酵母中,经G418的筛选,虽然得到了转化子,但是在含底物ABTS的MM平板上活性验证时,却一直得不到能正常表达漆酶酶活的转化子。2.丝状真菌表达载体的构建。以平菇POXC漆酶基因替代表达载体PAN7-1中全部hph基因构建丝状真菌表达载体pAN7-1’-CDNA.3.POXC漆酶基因的同源转化。采用PEG-Cacl2共转化质粒PAN7-1、pAN7-1’-CDNA于平菇原生质体,原生质体再生后,通过潮霉素筛选及分子手段检测转化子,结果发现在挑选的基因,其中有若干转化子中检测到了外源漆酶基因POXC。这些转化子在PDA平板中的生长速度与出发菌株并无明显差异,推测可能是因为PDA中并不含木质素,所以漆酶的作用并不明显。试管实验方差分析的结果显示与对照相比较各转化子的生长速度没有明显差异,推测可能是因为外源基因导入后并未真正的发挥作用。测定转化子在不同的培养条件下的酶活,得出的结果也并不一致,其中在大试管中的转化子的酶活均低于出发菌株的酶活,推测可能是因为测量是所含的菌丝量过低。在平板菌丝中和摇瓶测得的胞外胞内酶活中,有数个转化子的酶活力明显高于出发菌株,但是,对于这些转化子,在进一步的RNA表达量验证中,却得不到相应的结果,推测可能是发生了共抑制,需要进一步验证确定。
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