研究背景：细胞分化就是由一种相同的细胞类型经过细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异,产生不同的细胞类群的过程。骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells BMSCs)为中胚层发育的早期细胞,具有多向分化潜能,可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞甚至神经细胞等成熟细胞。人脐带血间充质干细胞在体外培养条件下能够分化成具有功能的肝细胞。还有证据表明卵圆细胞也有可能来自于BMSCs进一步分化成肝细胞。此外,已有一整套特殊的诱导机制保证了BMSCs能转化为肝细胞。BMSCs可以成功分化为肝细胞,但是控制这一过程的确切机制还不清楚。随着骨髓间充质干细胞的多向分化潜能不断被研究,其正被逐渐用于临床某些疾病的治疗过程中。Notch家族是由一组高度保守的蛋白质组成,在哺乳动物中Notch家族有四个Notch受体(Notch1-4)和五个配体,即两个Serrate样基因(Jagged1-2)和三个Delta样基因(Dll1,3和4)当配体与受体结合后Notch受体的胞内形式在细胞表面释放的Presenilin(PS)/γ-水解酶的作用下水解裂变。释放出其活化形式(NICD)与CSL DNA结合蛋白(CBF1, Su(H), Lag-2)结合,将CBF1一个转录抑制因子转变为转录活化因子。Notch信号通路对器官发育至关重要,Notch信号通路与细胞的生长增殖有着密切相关的牵连,Notch信号可由相邻细胞之间配体受体作用引发,进而引起蛋白酶剪切反应。研究表明,Notch蛋白的表达可以抑制细胞向特定的方向分化,典型的例子是Notch通路对周围神经分化的调节。同时也有研究报道称激活Notch信号通路可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。Notch信号通路在骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中的表达特征却很少见有报道,本课题首先分离培养骨髓间充质干细胞,然后用制备的诱导液对培养的骨髓间充质干细胞进行诱导分化,以研究Notch信号通路在骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中的作用,探讨其可能的分子机制,为体外获得大量的肝细胞寻找理想的途径,对细胞移植有重要的意义。目的：探寻Notch信号通路对BMSCs向肝细胞分化过程中的分子影响机制,为临床上肝细胞移植提供基础性研究。方法：1.肝损动物模型的构建：通过0.25%2-乙酰氨基芴(2-AAF)溶液灌胃及腹腔注射四氯化碳,成功构建了肝损动物模型,以便后继实验使用。2.肝组织萃取物(诱导液)的制备：将用四氯化碳(CC14)和2-乙酰氨基芴(2-AFF)制造的肝损伤动物模型的肝萃取物作为BMSCs诱导分化的刺激因子。将BMSCs植入含有肝损伤动物模型肝萃取物的(DMEM-F12)这一混合培养基中。对照组的培养基里用正常的动物肝萃取物取代实验组的肝损的肝萃取物。分别提取第Od,7d,11d,21d的两组BMSCs进行实验。3.骨髓间质干细胞(BMSCs)的获取及鉴定：将实验所需的SD大鼠用乙醚窒息法处死。再将SD大鼠胫骨骨髓腔中的骨髓收集在培养基中,取第四代培养细胞进行鉴定,通过流式细胞术检测细胞表面分子标记表明成功获得骨髓间质干细胞。4.骨髓间质干细胞的诱导分化及分化状态的鉴定：用获得的大鼠肝脏组织萃取物对第四代培养的骨髓间质干细胞进行诱导,每三天换液一次,培养21天,选择若干细胞表面标记对培养细胞进行RT-PCR鉴定：M2-PK,GST-P, Albumin,Bst-1,用于表明已经成功诱导了骨髓间质干细胞向肝细胞的分化。5.将BMSCs加入Jaggedl进行共培养,Jaggedl是一种可溶性的蛋白,按照浓度为10ng/ml的比例加入到含有肝损伤萃取物的DMEM培养基中。6.BMSCs与Jagged1共培养发现Notch的下游基因Hesl及Heyl的表达量明显上调,BMSCs与DAPT共培养发现Notch的下游基因Hesl及Heyl的表达量明显下调。Notch信号通路可能起对BMSCs肝向分化的抑制作用。单独用DAPT或Jagged1与DAPT联合作用于BMSCs均不显示对BMSC的分化有影响。结果：本实验成功构建了肝损大鼠动物模型,且分离了可以用于诱导分化的诱导液。本实验所需的骨髓间充质干细胞在贴壁培养至第4代后。利用Hoechst33342染色验证其纯度,结果发现底部附着细胞都成呈阳性的染色,Hoechst33342阳性结果证明所分离的细胞符合BMSCs的细胞特性。经过流式细胞测试第四代骨髓间充质干细胞中的CD29和CD44高阳性率,CD34和CD45几乎不表达。符合骨髓间充质干细胞的特点,不是造血类的干细胞,而且其细胞特性稳定。在诱导因素作用的倒置相差显微镜镜下,少数贴壁不好的细胞出现凋亡现象,而幸存的细胞则继续增殖分化。在经诱导后的第7d和第11d细胞的形态没有很显著的变化,只是细胞的一些成纤维细胞样的形态消失了,转而变化为向四周扩展的扁平状的细胞形态。经诱导后的第21d,镜下发现了许多圆形和成梭形的细胞,其细胞形态与肝细胞相似,并经肝细胞的若干分子表达鉴定,鉴定的结果表明在细胞生长最初阶段,BMSCs只表达Bst-1。在经诱导分化后的11d时BMSCs的M2-PK和GST-P(幼稚肝细胞标志)都被表达了,当分化方向确定后的20d时检测到BMSCs的Albumin(成熟肝细胞标志)的mRNA被表达,相反BMSCs中BST-1的mRNA则在诱导后未检测到。而在对照组,BMSC在整个分化过程中只表达Bst-1这一髓源分子证明对照组的BMSCs未被分化保持着BMSCs的细胞特性。以上的实验表明骨髓间充质干细胞在经肝损模型的诱导后可以向肝细胞分化。同时在加入Jagged1共培养的BMSCs中实验结果明显上调Notch信号通路,促进下游基因Hes1/Hey1的mRNA的表达；另外一组加入DAPT可以显著阻断Notch信号通路,抑制下游基因Hesl/Heyl的]mRNA的表达。分析BMSCs分化状态后实验组直到26天都未表达Albumin(成熟肝细胞标志)正常组只需要21天。结论：这些结果证明在BMSCs向肝分化过程中必须有Notch信号通路的参与。Notch信号可能对骨髓间质干细胞向肝细胞分化起到了抑制作用。Nocth信号通路的下调可能有助于BMSCs的向肝细胞分化。为体外获得大量肝细胞提供了有力的基础,对需要肝细胞移植的疾病提供了重要工具。