魔芋甘露聚糖肽制备技术研究

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甘露聚糖肽(Mannatide),曾用名多抗甲素(Polyactin),是我国首创的一种新型免疫增强剂。大量临床研究表明,甘露聚糖肽能减轻放疗化疗的毒副作用,增强和调节患者的免疫功能,适用于免疫功能低下的各种疾病。目前国内制备甘露聚糖肽主要是通过a-溶血链球33#菌株经深层培养发酵提取而得。随着科研技术的进步,各种食源性多肽因其易吸收、无毒副作用、安全性高等优势,已成为制备生物活性肽的重要来源。我国是世界上魔芋种植量最大的国家,也是最大的魔芋生产国。目前我国对魔芋的利用主要集中在魔芋精粉(葡甘露聚糖),而魔芋精粉加工过程中产生的魔芋飞粉大多以饲料或干燥剂低价出售。研究表明,魔芋飞粉中含有丰富的甘露聚糖和蛋白质,是获得甘露聚糖肽的良好来源。本文以魔芋飞粉为原料,通过发酵法和酶解法制备了魔芋多肽;并以酶解法得到的魔芋多肽为实验材料,通过超滤分离,凝胶过滤色谱分离等方法从中分离出魔芋甘露聚糖肽,得到了以下结果:1.研究了魔芋多肽发酵法制备工艺,结果表明:以多肽得率为考察指标,通过单因素实验和正交实验,得出最佳发酵工艺条件为:菌种比例(米曲霉:枯草芽孢杆菌)1:2、接种量6mL、发酵时间40h、发酵温度34℃、发酵基质pH8.0,在此工艺条件下魔芋多肽的最高得率为5.78%。2.研究了魔芋多肽酶解法制备工艺。以水解度为考察指标,分别采用碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解魔芋飞粉,结果表明:酶解魔芋飞粉制备魔芋多肽的最佳用酶为碱性蛋白酶。以魔芋多肽得率为考察指标,通过单因素实验和正交实验,确定出最佳的酶解工艺条件为:料液比1:20、酶解温度50℃、酶解时间180min、酶解环境的pH8.0、加酶量3300U/g,在此工艺条件下魔芋多肽的最高得率为8.72%。3.采用超滤分离将魔芋多肽分离成了四个分子量区段,即区段Ⅰ(M>300KDa)、区段Ⅱ(100KDa<M<300KDa)、区段Ⅲ(10KDa<M<100KDa)和区段Ⅳ(M<10KDa),多肽总的回收率为73.37%,其中10KDa<M<100KDa区段的分子量范围与甘露聚糖肽标准品一致,初步判断其主要为甘露聚糖肽。采用Sephadex G-100凝胶过滤色谱对超滤后的10KDa<M<100KDa区段的甘露聚糖肽进行了进一步分离,得到了N1、N2和N3三个组分。研究得出的最佳洗脱条件为:洗脱剂为蒸馏水,上样量为5mL,样品浓度为150mg/mL,洗脱流速为0.8mL/min。通过SDS-PAGE测定了N1,N2和N3组分的分子量,得出N1组分的分子量范围为70~100KDa,N2组分的分子量范围为30KDa~70KDa,N3组分的分子量范围为10KDa~20Kda。将甘露聚糖肽标准品与Sephadex G-100分离后的N1,N2和N3组分的氨基酸图谱进行比对得知:N2组分与甘露聚糖肽的相似度最高,测定得知其中的甘露聚糖肽含量为0.307mg/mL。4.对Sephadex G-100分离后的N2组分的化学组成进行了分析。结果表明: N2组分中氨基酸的种类和魔芋飞粉基本一致,但氨基酸总量有所降低;N2组分所含的单糖主要为甘露糖和葡萄糖,二者的比例为0.78。
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