中国大鲵Sox4a、Sox4b、Sox4c及Sox7基因cDNA序列的克隆和组织表达分析

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Sox (SRY-box containing)基因在动物界广泛存在,目前已在鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类动物中发现超过100个成员,根据HMG盒的相似性,将其划分为A-K 11个亚族。Sox4基因是SoxC亚族成员之一,在胚胎发育中起着至关重要的作用,主要参与心脏、淋巴细胞、中枢神经系统、内分泌胰岛、造血细胞、性腺等多种器官的发育。Sox7基因属于Sox家族F亚族,主要参与胚胎发育和细胞命运的决定。Sox7基因不仅能够诱导Nodal信号分子、中胚层相关基因以及内胚层分化基因的表达,而且是内胚层Veg-T信号途径所需的标志物。本研究以中国特有的大型珍稀二级保护物种,唯一尚存的隐鳃鲵科两栖动物一中国大鲵(Andrias davidianus)为研究对象,采用逆转录聚合酶链反应(]RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得中国大鲵Sox4基因的3个同系物:Sox4a、Sox4b、Sox4c及Sox7基因的cDNA序列,对其进行生物信息学分析,并通过荧光定量PCR技术进行各组织间表达情况的分析,主要取得如下结果:1. Sox4a基因的cDNA序列为1153 bp,编码224个氨基酸,位于59-130之间的HMG-box是其主要功能区,同源性分析表明中国大鲵Sox4a编码蛋白与其他物种Sox4a蛋白同源性在63.8%-97.2%之间;对不同物种的Sox4a蛋白构建系统发育树可知:鲤鱼(Cyprinus carpio)与施氏鲟(Acipenser schrenckii)从进化树最先分出,随后两栖类的中国大鲵与饰纹姬蛙(Microhyla ornata)聚成一支,鳙鱼(Hypophthalmichthys nobilis)与斑马鱼(Danio rerio)最后分出,说明Sox4a基因是一个古老的基因,且从中国大鲵到鱼类的进化速度比较快,Sox4a基因的基因复制时间可能在鳙鱼与斑马鱼分化之前。Sox4b基因的cDNA序列为1058 bp,编码193个氨基酸,位于59-130之间的HMG-box是其主要功能区,同源性分析表明中国大鲵Sox4b编码蛋白与其他物种Sox4b蛋白同源性在60.3%-97.1%之间;对不同物种的Sox4b蛋白构建系统发育树可知饰纹姬蛙最早从进化树分出,随后是鲤鱼、瓣结鱼(Folifer brevifilis)等几种鱼类,中国大鲵与金线蛙(Pelophylax plancyi)聚成一支最后从进化树分出。Sox4c基因的cDNA序列为996bp,编码149个氨基酸,位于59-130之间的HMG-box是其主要功能区, Sox4c基因目前仅在饰纹姬蛙获得部分核苷酸片段,将其推导蛋白与中国大鲵Sox4c序列进行比对,两者同源性高达81.7%。2.Sox7基因的cDNA序列长为847bp,编码188个氨基酸,位于44-115之间的HMG-box是其主要功能区,中国大鲵Sox7编码蛋白与其他物种Sox7蛋白同源性在64.1-76.8%之间;对不同物种的Sox7蛋白构建系统发育树可知Sox7基因是一个比较古老的基因,在鱼类、两栖、爬行、哺乳均有存在,中国大鲵与非洲爪蟾、热带爪蟾两栖类聚在一起基本符合物种进化的历程。3.从NCBI下载、查阅文献及本实验室先前所得的中国大鲵Sox基因家族:Sox2、Sox3、Sox4a、Sox4b、Sox4c、Sox7、Sox9、Sox11、Soxl4a、Soxl4b、Sox19共11个成员。利用MEGA 5.0软件,采用邻接法(Neighbor-joining method)重复1000次对这11个Sox基因成员构建系统发育树,结果显示:Sox4a、Sox4b、Sox4c及Soxll汇聚在一起分化出来,显示其较原始的进化地位、Sox9及Sox7聚在一起随后分出,Sox14的2个同系物、Sox2、Sox19及Sox3最后分出。4.利用荧光定量PCR方法分析中国大鲵Sox4和Sox7基因的组织表达情况,结果显示:Sox4基因在性成熟的中国大鲵各组织表达量均比较低,相对而言在肠道表达量最高,心脏、卵巢、垂体的表达量次之,肝脏中的表达量极低,脑及肾脏中几乎不表达。Sox7基因在所有检测的组织中均有表达,且在肾脏中的表达量最高,肠道、心脏、脑以及卵巢的表达量次之,垂体中的表达量较低,肝脏表达量极低。
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