一、脐带间充质干细胞分离、培养、鉴定以及对T淋巴细胞的抑制作用　　 目的：　　 探讨小鼠脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的分离、培养体系的建立及其在体外对T淋巴细胞的抑制作用。　　 方法：　　 采用双酶消化法消化C57BL/6孕鼠脐带组织，进行贴壁分离和传代培养，绘制细胞生长曲线。通过倒置显微镜观察细胞形态，用流式细胞仪检测细胞表面标志，免疫细胞化学法对UC-MSCs进行成脂、成骨和成软骨定向诱导。免疫磁珠分选小鼠脾脏T淋巴细胞。3H-TdR掺入法检测UC-MSCs对PHA刺激后T细胞增殖的抑制作用，ELISA法检测培养基上清液中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平变化。　　 结果：　　 (1) UC-MSCs在培养瓶中贴壁生长，逐渐纯化，呈成纤维细胞形态，放射状或旋涡状生长；高表达CD73、CD90、CD105，不表达CD34、CD45、HLA-DR、CD19、CD11b分子；在体外能向成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞方向分化。(2)免疫磁珠分选小鼠脾脏T淋巴细胞的纯度高于90％。(3)UC-MSCs可抑制活化T细胞体外增殖，调节IFN-γ、 IL-2、IL-4、IL-10的分泌，并呈数量依赖性。　　 结论：　　 采用双酶消化法可以成功分离、培养出孕鼠UC-MSCs; UC-MSCs在体外具有抑制T细胞增殖的作用，调节炎症因子IFN-γ、 IL-2、IL-4、IL-10的分泌。　　 二、Qa-2参与脐带间充质干细胞抑制活化T淋巴细胞增殖的免疫调控　　 目的：　　 探讨UC-MSCs对T淋巴细胞的增殖产生抑制效应的同时，其分泌Qa-2蛋白对T淋巴细胞内TC-PTP和Lck信号分子的免疫调控效应。　　 方法：　　 CFSE和DAPI染料对UC-MSCs和T淋巴细胞体外染色。采用ELISA法、流式细胞术及RT-PCR、Western-blot分析UC-MSCs表达的H2-Q7基因和Qa-2蛋白，以及在MLR体系中不同时间点H2-Q7基因和Qa-2蛋白变化。Qa-2单克隆抗体对UC-MSCs抑制活化T淋巴细胞增殖中的阻断作用及阻断作用对培养体系中细胞因子IFN-γ和IL-1O水平的影响。RT-PCR、Western-blot法检测不同培养代数UC-MSCs中H2-Q7基因和Qa-2蛋白的变化情况。ELISA法检测rmIFN-γ干预后培养基上清液中Qa-2蛋白的分泌水平。　　 结果：　　 (l) UC-MSCs经CFSE和DAPI染色后，胞浆为绿色，胞核为蓝色，界限清晰。(2) UC-MSCs对T淋巴细胞的增殖有明显的抑制作用，在MLR体系中加入Qa-2单克隆抗体后，其抑制作用得到部分逆转。Transwell试验表明在UC-MSCs与T淋巴细胞无接触情况下，仍有部分抑制作用。(3)在MLR体系中加入Qa-2单克隆抗体后，IFN-γ水平轻度上升(P=0.0015)，而IL-10水平轻度下降(P=0.0034)。(4)在1、3、5代UC-MSCs中，H2-Q7和Qa-2的表达量随代数增加而逐步下降。(5)流式细胞术分析结果显示，UC-MSCs表面和胞浆中均有Qa-2蛋白，阳性率分别为58.75%和46.21%。(6) MLR体系中，在共培养1h、12h、24h、36h的4个时间点，Lck mRNA变化为先下降后逐渐上升至正常水平，其变化呈现一过性改变；p56Lck蛋白在24h、36h、48h、60h的4个时间点也有类似的变化。TC-PTP mRNA在1h、12h、24h、36h的4个时间点变化为先上升后逐渐下降至正常水平，其变化呈现一过性改变；TC-PTP蛋白在24h、36h、48h、60h的4个时间点也有类似的变化。(7）在rmIFN-γ干预下，UC-MSCs分泌Qa-2蛋白量增加，且与rmIFN-γ呈数量依赖性。　　 结论：　　 小鼠UC-MSCs分泌、表达Qa-2蛋白，且与rmIFN-γ呈数量依赖性。不同代数UC-MSCs表达的Qa-2蛋白量是不同的，随着代数的增加，其表达量减少。Qa-2蛋白参与UC-MSCs对活化T淋巴细胞增殖的抑制作用，并可能对T淋巴细胞内TC-PTP和p56Lck信号分子产生免疫调控作用。　　 三、脐带间充质干细胞移植对实验性小鼠自身免疫性肝炎的免疫调控治疗　　 目的：　　 建立实验性自身免疫性肝炎(EAH)小鼠动物模型，探讨经尾静脉输注UC-MSCs对EAH的治疗效果。　　 方法：　　 将6-8周龄雄性C57BL/6小鼠的肝脏经冷PBS门静脉灌注后取出，置冰上将肝脏剪碎、匀浆，使肝细胞内蛋白质充分释出。将匀浆以150×g离心l0min以去除细胞核部分，然后用超速离心机以100000×g的速度离心1h。该上清液即含肝抗原，称为S-100抗原，再经琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B柱分离S-100，即可收集到3个蛋白峰，收集第1峰和第3峰，即为LSP。48只小鼠随机分为2组，采用1.25g/L的LSP(0.5ml)联合等体积的完全弗氏佐剂充分乳化后经腹腔2次注射C57BL/6小鼠，建立EAH模型，分别于第7、14、21和28天4个时间点各处死6只，采集外周血，收集血清，检测ALT、TBIL、ALB，取出肝脏组织，行肝脏组织HE染色。确定模型成功后，按上述方法再次造模，共72只EAH小鼠，并于造模后1周开始UC-MSCs移植治疗，分为A、B、C三组：A组（实验组）：经尾静脉移植0.5mL经rmIFN-γ干预的UC-MSCs1×106个(CFSE标记，n=6)；B组（移植对照组）：经尾静脉移植0.5mL的UC-MSCs1×106个(CFSE标记，n=6)；C组（空白对照组）：经尾静脉注射0.5mL生理盐水(n=6)；在治疗后1、2、3、4周检测小鼠肝功能和肝脏病理学检查，ELISA法检测血清中IFN-γ，IL-4，IL-10水平。　　 结果：　　 造模后小鼠表现为活动明显减少，常显萎靡、嗜睡状，对外界刺激反应迟钝，皮毛稀疏干燥、晦暗，尿色变黄，体重增长速度慢。造模后第1、2、3和4周病理检查发现肝脏病变，在中央静脉、肝窦及门管区的小叶间动、静脉间观察到不同程度的炎症反应，炎性细胞主要以淋巴细胞为主，淋巴细胞弥漫分布于中央静脉周围的肝窦内，部分破坏肝小叶正常结构，呈点状坏死、片状坏死，部分甚至出现气球样变。血清TBIL、ALT在上述时间点逐步升高，ALB有所降低，白球比倒置明显，造模前后各指标均有统计学意义(P＜0.05)。UC-MSCs移植治疗后第2周起，A、B组ALT、TBIL均有下降，而C组仍上升，A、B组与C组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)；ALB在第3周起，在A、B组均有不同程度上升，而在C组逐步下降，A、B组与C组相比，差异有统计学意义(P＜0.01)；到第4周，A组与B组的TBIL、ALT均明显下降，但A组与B组相比，具有统计学意义(P＜0.05)。在肝脏病理组织学方面，在移植后2周，A、B组小鼠肝小叶中央区仍有少量肝细胞坏死，肝细胞脂肪变性、炎性细胞浸润，但较C组有改善。移植治疗后4周，A、B组小鼠肝脏组织明显修复，炎性细胞浸润明显减少，肝小叶结构相对完整，两组之间无明显差异，而C组肝脏组织无改善，仍有肝小叶结构紊乱以及炎性细胞浸润。治疗后第1、2、3、4周，肝组织切片在荧光显微镜下均可见到UC-MSCs在肝组织聚集；治疗后1周，A、B组与C组相比，IFN-γ明显降低，IL-4、IL-10轻度上升，A、B组与C组相比，差异有统计学意义(P＜0.01)。　　 结论：　　 UC-MSCs经尾静脉移植治疗小鼠EAH，能够有效促进小鼠肝功能修复，减轻肝脏组织的炎症反应，对EAH具有一定的治疗作用。UC-MSCs在肝组织聚集，推测可能在病灶局部，通过自分泌方式分泌Qa-2而发挥治疗作用；UC-MSCs可能利用Qa-2参与免疫调节作用使促炎因子与抗炎因子达到新的平衡，这可能是UC-MSCs移植治疗EAH的作用机制之一。　　 四、脐带间充质干细胞移植治疗自身免疫性肝病的疗效和安全性的初步研究　　 目的：　　 探讨经外周静脉输注UC-MSCs治疗AILD患者的疗效和安全性。　　 方法：　　 2009年10月至2010年9月在苏州大学附属第一医院肝病科接受UC-MSCs移植治疗的7例AILD患者，男性2例，女性5例，中位年龄57(53-68)岁。其中AIH2例，PBC1例，PSC3例，OLS1例。UC-MSCs移植治疗次数均为2次。两次治疗间隔平均为1个月，所有患者均采用外周静脉输注UC-MSCs，数量为8×107个/次，滴速为100d/min。随访至治疗后24个月，观察UC-MSCs的治疗效果和安全性。观察患者在治疗过程中及治疗后有无畏寒、恶心呕吐、发热、皮疹及有无其他过敏症状；观察治疗后患者食欲、乏力、皮肤瘙痒、肝区不适、腹胀腹痛情况有无好转，每3个月进行一次肝功能、肾功能、血常规、腹部超声和AFP、IFN-γ和IL-4检查。　　 结果：　　 (1)治疗过程是安全的，未见患者有UC-MSCs引起的栓塞症状，操作全部成功，均无畏寒发热、恶心呕吐、皮疹及其他过敏症状等不良反应。术后随访未见血常规、肾功能明显异常，未发生与UC-MSCs移植相关的严重并发症，彩色多普勒未发现患者肝脏有肿瘤迹象，患者血清AFP监测未发现有异常升高。UC-MSCs移植治疗后也未发现任一患者有肝性脑病等症状出现。(2)截止随访24个月，所有7例患者中，有1例于随访10个月时失访，予以剔除，其余6例均达到缓解标准。患者临床症状好转，表现为乏力、黄疸、腹胀、皮肤瘙痒等减轻，食欲增加。治疗前后患者ALB分别为33.51±5.32g/L,38.85±6.98;ALT分别为69.95±47.96U/L,39.65±18.87U/L; AST分别为65.71±43.64U/L,35.52±17.24U/L，治疗前后相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)。治疗前后患者血清IFN-γ均有不同程度下降(P=0.0368)，IL-4均有不同程度的上升(P=0.0418)。　　 结论：　　 通过外周静脉输注UC-MSCs移植治疗AILD，可改善患者的症状，有效促进患者肝功能的好转，移植后无明显的不良反应，使患者体内免疫紊乱得到部分纠正，而且这一治疗过程操作简便，安全可行。