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目的：
胰腺导管腺癌（简称胰腺癌）是恶性度极高，预后最差的人类消化系统恶性肿瘤。胰腺癌具有高度侵袭性，其侵袭及转移速度往往非常之快，是导致其死亡率高和预后不佳的重要原因之一。上皮-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）是肿瘤侵袭转移的关键初始步骤，大量的研究证明转化生长因子-β（Transforming Growth Fator-β，TGF-β）可以通过Smad信号通路促进肿瘤细胞的侵袭转移。YAP1（Yes Associated Protein1）是一种辅助转录因子，是Hippo pathway下游的两个效应蛋白之一（TAZ/YAP1）。其存在两种亚型：YAP1-1和YAP1-2。实验室前期成功构建了YAP1的两种亚型，并在敲除内源YAP的基础上，获得稳定单YAP1亚型重组表达胰腺癌细胞株：L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2。本文主要研究YAP1各亚型在TGF-β诱导的胰腺癌细胞EMT中的作用和机制，并讨论TGF-β对YAP1信号通路的影响。
方法：
通过Western Blot检测L3.6、Panc1和PATU8988T三种胰腺癌细胞系中，YAP1和EMT相关标志物（E-Cadherin、Vimentin）的表达情况。通过细胞划痕，Transwell实验观察L3.6、Panc1和PATU8988T三种胰腺癌细胞转移、侵袭能力的变化。
使用TGF-β、bFGF、EGF刺激胰腺癌细胞L3.6细胞，构建L3.6细胞的EMT模型。通过细胞划痕，Transwell实验观察L3.6细胞中，细胞转移、侵袭能力的变化。
通过细胞划痕，Transwell实验观察8种稳定单YAP1亚型表达的L3.6细胞株，细胞的转移、侵袭能力。
观察YAP1不同亚型的细胞株在TGF-β诱导的上皮-间充质转化进程中的表型变化。使用TGF-β刺激胰腺癌细胞株L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2，构建L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2细胞株的EMT模型。通过细胞划痕，Transwell实验观察L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2细胞株在TGF-β诱导前后，胰腺癌细胞转移、侵袭能力的变化。另外，通过Western Blot和qRT-PCR实验检测YAP1不同亚型的胰腺癌细胞株在TGF-β刺激前后，EMT相关标记物（E-Cadherin、Vimentin、Snail）和YAP1在蛋白和mRNA水平上的表达情况。
研究在TGF-β诱导的上皮-间充质转化进程中YAP1不同亚型胰腺癌细胞株的机制差异。通过核质蛋白分离实验、免疫共沉淀实验和免疫荧光实验，观察L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2细胞株在TGF-β诱导前后，YAP1蛋白在胞核与胞浆的定位变化。通过加入蛋白生物合成抑制剂（Cycloheximide，CHX），检测L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2细胞株在TGF-β诱导前后，YAP1蛋白的稳定性变化。
深入探讨TGF-β介导的AKT信号通路对YAP1不同亚型的影响。通过Western Blot和qRT-PCR实验检测YAP1不同亚型的细胞株在抑制AKT信号通路前后，EMT相关标记物（E-Cadherin、Vimentin、Snail）和YAP1在蛋白和mRNA水平上的表达情况。另外，通过细胞划痕，Transwell实验观察L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2细胞株在抑制AKT信号通路前后，细胞转移、侵袭能力的变化。通过免疫荧光实验，观察L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2细胞株在抑制AKT信号通路前后，其YAP1蛋白在胞核与胞浆的定位变化。
结果：
1.在胰腺癌细胞中YAP1对EMT的影响：敲除内源YAP1基因以后，L3.6细胞的侵袭转移能力明显减弱。而且，在另两种胰腺癌细胞系Panc1和PATU8988T上，验证了YAP1对胰腺癌EMT的影响。（P值均＜0.05）
2.生长因子对胰腺癌细胞EMT的影响：生长因子TGF-β、bFGF、EGF能够增强L3.6细胞的侵袭、转移能力，其中，TGF-β的影响作用较明显。（P值均＜0.05）
3.YAP1各亚型在胰腺癌细胞中的转移、侵袭能力：L3.6-YAP1-1细胞株的迁移能力要普遍强于L3.6-YAP1-2细胞株。而且，8种亚型的迁移能力也有所差异。初步证明YAP1各亚型结构上的差异会导致其功能上的差异，从而影响其诱导胰腺癌发生EMT的能力。（P值均＜0.05）
4.在TGF-β诱导的上皮-间充质转化进程中，YAP1不同亚型细胞株的表型变化：TGF-β诱导前，相较于L3.6-YAP1-1细胞，L3.6-YAP1-2细胞的E-Cadherin的蛋白和mRNA水平表达较高，Vimentin和Snail的蛋白和mRNA水平表达较低；细胞的转移、侵袭能力较低。TGF-β诱导后，相较于L3.6-YAP1-1细胞，L3.6-YAP1-2细胞的E-Cadherin的蛋白和mRNA水平表达下降，Vimentin和Snail的蛋白和mRNA水平表达上升；细胞的转移、侵袭能力也上升。（P值均＜0.05）
5.在TGF-β诱导的上皮-间充质转化进程中，YAP1不同亚型机制的差异：TGF-β诱导前，YAP1-2蛋白大多数分布在胞浆内，少数分布在核内；TGF-β诱导后，YAP1-2蛋白大量在核内聚集，YAP1-2蛋白的入核是由泛素化降解引起的。TGF-β诱导后，L3.6-YAP1-2细胞的降解情况得到缓解，稳定性显著提高。（P值均＜0.05）
6.TGF-β介导的AKT信号通路对YAP1不同亚型的影响：TGF-β诱导的同时加入P-AKT抑制剂（MK-2206）后，相较于仅TGF-β诱导后，L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2细胞的E-Cadherin蛋白水平较高，Vimentin，Snail和YAP1的蛋白水平较低。TGF-β诱导的同时加入MK-2206，相较于仅TGF-β诱导后，L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2细胞的转移、侵袭能力均被抑制。（P值均＜0.05）
结论：
YAP1-2在TGF-β诱导的胰腺癌细胞EMT进程中起到重要作用。TGF-β可以通过激活AKT信号通路改变YAP1-2的蛋白定位和稳定性，进而促进胰腺癌细胞发生上皮-间充质转化。本研究为胰腺癌治疗的靶点提供了新的治疗方案。
胰腺导管腺癌（简称胰腺癌）是恶性度极高，预后最差的人类消化系统恶性肿瘤。胰腺癌具有高度侵袭性，其侵袭及转移速度往往非常之快，是导致其死亡率高和预后不佳的重要原因之一。上皮-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）是肿瘤侵袭转移的关键初始步骤，大量的研究证明转化生长因子-β（Transforming Growth Fator-β，TGF-β）可以通过Smad信号通路促进肿瘤细胞的侵袭转移。YAP1（Yes Associated Protein1）是一种辅助转录因子，是Hippo pathway下游的两个效应蛋白之一（TAZ/YAP1）。其存在两种亚型：YAP1-1和YAP1-2。实验室前期成功构建了YAP1的两种亚型，并在敲除内源YAP的基础上，获得稳定单YAP1亚型重组表达胰腺癌细胞株：L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2。本文主要研究YAP1各亚型在TGF-β诱导的胰腺癌细胞EMT中的作用和机制，并讨论TGF-β对YAP1信号通路的影响。
方法：
通过Western Blot检测L3.6、Panc1和PATU8988T三种胰腺癌细胞系中，YAP1和EMT相关标志物（E-Cadherin、Vimentin）的表达情况。通过细胞划痕，Transwell实验观察L3.6、Panc1和PATU8988T三种胰腺癌细胞转移、侵袭能力的变化。
使用TGF-β、bFGF、EGF刺激胰腺癌细胞L3.6细胞，构建L3.6细胞的EMT模型。通过细胞划痕，Transwell实验观察L3.6细胞中，细胞转移、侵袭能力的变化。
通过细胞划痕，Transwell实验观察8种稳定单YAP1亚型表达的L3.6细胞株，细胞的转移、侵袭能力。
观察YAP1不同亚型的细胞株在TGF-β诱导的上皮-间充质转化进程中的表型变化。使用TGF-β刺激胰腺癌细胞株L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2，构建L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2细胞株的EMT模型。通过细胞划痕，Transwell实验观察L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2细胞株在TGF-β诱导前后，胰腺癌细胞转移、侵袭能力的变化。另外，通过Western Blot和qRT-PCR实验检测YAP1不同亚型的胰腺癌细胞株在TGF-β刺激前后，EMT相关标记物（E-Cadherin、Vimentin、Snail）和YAP1在蛋白和mRNA水平上的表达情况。
研究在TGF-β诱导的上皮-间充质转化进程中YAP1不同亚型胰腺癌细胞株的机制差异。通过核质蛋白分离实验、免疫共沉淀实验和免疫荧光实验，观察L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2细胞株在TGF-β诱导前后，YAP1蛋白在胞核与胞浆的定位变化。通过加入蛋白生物合成抑制剂（Cycloheximide，CHX），检测L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2细胞株在TGF-β诱导前后，YAP1蛋白的稳定性变化。
深入探讨TGF-β介导的AKT信号通路对YAP1不同亚型的影响。通过Western Blot和qRT-PCR实验检测YAP1不同亚型的细胞株在抑制AKT信号通路前后，EMT相关标记物（E-Cadherin、Vimentin、Snail）和YAP1在蛋白和mRNA水平上的表达情况。另外，通过细胞划痕，Transwell实验观察L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2细胞株在抑制AKT信号通路前后，细胞转移、侵袭能力的变化。通过免疫荧光实验，观察L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2细胞株在抑制AKT信号通路前后，其YAP1蛋白在胞核与胞浆的定位变化。
结果：
1.在胰腺癌细胞中YAP1对EMT的影响：敲除内源YAP1基因以后，L3.6细胞的侵袭转移能力明显减弱。而且，在另两种胰腺癌细胞系Panc1和PATU8988T上，验证了YAP1对胰腺癌EMT的影响。（P值均＜0.05）
2.生长因子对胰腺癌细胞EMT的影响：生长因子TGF-β、bFGF、EGF能够增强L3.6细胞的侵袭、转移能力，其中，TGF-β的影响作用较明显。（P值均＜0.05）
3.YAP1各亚型在胰腺癌细胞中的转移、侵袭能力：L3.6-YAP1-1细胞株的迁移能力要普遍强于L3.6-YAP1-2细胞株。而且，8种亚型的迁移能力也有所差异。初步证明YAP1各亚型结构上的差异会导致其功能上的差异，从而影响其诱导胰腺癌发生EMT的能力。（P值均＜0.05）
4.在TGF-β诱导的上皮-间充质转化进程中，YAP1不同亚型细胞株的表型变化：TGF-β诱导前，相较于L3.6-YAP1-1细胞，L3.6-YAP1-2细胞的E-Cadherin的蛋白和mRNA水平表达较高，Vimentin和Snail的蛋白和mRNA水平表达较低；细胞的转移、侵袭能力较低。TGF-β诱导后，相较于L3.6-YAP1-1细胞，L3.6-YAP1-2细胞的E-Cadherin的蛋白和mRNA水平表达下降，Vimentin和Snail的蛋白和mRNA水平表达上升；细胞的转移、侵袭能力也上升。（P值均＜0.05）
5.在TGF-β诱导的上皮-间充质转化进程中，YAP1不同亚型机制的差异：TGF-β诱导前，YAP1-2蛋白大多数分布在胞浆内，少数分布在核内；TGF-β诱导后，YAP1-2蛋白大量在核内聚集，YAP1-2蛋白的入核是由泛素化降解引起的。TGF-β诱导后，L3.6-YAP1-2细胞的降解情况得到缓解，稳定性显著提高。（P值均＜0.05）
6.TGF-β介导的AKT信号通路对YAP1不同亚型的影响：TGF-β诱导的同时加入P-AKT抑制剂（MK-2206）后，相较于仅TGF-β诱导后，L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2细胞的E-Cadherin蛋白水平较高，Vimentin，Snail和YAP1的蛋白水平较低。TGF-β诱导的同时加入MK-2206，相较于仅TGF-β诱导后，L3.6-YAP1-1和L3.6-YAP1-2细胞的转移、侵袭能力均被抑制。（P值均＜0.05）
结论：
YAP1-2在TGF-β诱导的胰腺癌细胞EMT进程中起到重要作用。TGF-β可以通过激活AKT信号通路改变YAP1-2的蛋白定位和稳定性，进而促进胰腺癌细胞发生上皮-间充质转化。本研究为胰腺癌治疗的靶点提供了新的治疗方案。