目的:特发性肺纤维化（IPF）是一种破坏性、进行性、致死性疾病,患者平均存活期为3-5年,但其致病机制仍未完全了解[1]。IPF的特点是反复的肺泡上皮细胞（AEC）损伤和修复,上皮间质转分化（EMT）,成纤维细胞异常增殖与活化,细胞外基质沉积,最终导致肺实质的破坏[2],上皮细胞损伤和增生是促进IPF的关键事件。ESCRT系统（The endosomal sorting complex required for transport,转运必需内吞体分选复合物）是一个多功能的蛋白转运及膜剪切机器,参与多种膜结合受体的信号通路调节途径[3],维持上皮细胞[4]、成纤维细胞的极性[5],多泡体是Ⅱ型肺泡上皮细胞的标志性细胞器lamellarbody的前体,ESCRT系统很重要的功能便是调控多泡体的形成。Chmp1b/1a（Charged multivesicular body protein 1b/1a）作为ESCRT系统重要成员,在肺组织中的分布与在肺纤维化发生中的作用尚无研究报道。目前对于上皮细胞是否发生EMT,是否是肺纤维化间质细胞的主要起源仍存在争议,有研究者使用SPC-rt TA/tet O7-Cre/lac Z系统自胚胎期标记显示纤维化过程中存在EMT[6],而另外的学者使用SPC-Cre ER T2敲入等位基因追踪Ⅱ型肺泡细胞（AECII）却显示AECII不存在EMT[7]。针对这一致命性疾病,通过生物大分子的共定位关系识别各种细胞类型,寻找合适的分子标志,利用细胞识别与追踪技术追踪肺纤维化发生时肺泡上皮与间质细胞,确定细胞分化状态与分化路径,探寻影响肺纤维化发生及病程发展的相关因素,这对于发现有效的治疗手段是至关重要的。本课题尝试寻找针对同一切片剥离抗体以进行重复多次免疫组化染色的方法,利用该方法明确Chmp1b/1a在小鼠肺组织内的分布情况、与肺内常见细胞标志物的共定位情况、与纤维化病变的关系。自SPC-rt TA/tet O7-Cre系统转基因小鼠末梢肺组织AECII分别特异性敲减Chmp1b和Chmp1a建立肺纤维化小鼠模型,分析Chmp1b/1a对肺纤维化产生的影响。使用SPC-rt TA/tet O7-Cre/m Tm G系统转基因小鼠自成体诱导标记气道上皮细胞后,建立肺纤维化小鼠模型,以明确肺纤维化过程中上皮细胞对于EMT的贡献。通过检查LIF标志物ADRP在肺纤维化过程中的分布情况,及其与巨噬细胞、成纤维细胞等标志分子共定位情况了解ADRP阳性细胞与纤维化病程的关系,从而验证了免疫组化抗体剥离技术的有效性。研究方法:本研究分为四部分,第一部分选取野生型小鼠为研究对象,腹腔注射博来霉素造模,利用免疫组织化学抗体剥离重复染色和Realtime PCR等方法,从表达分布和表达量两个方面探讨正常肺组织和纤维化肺组织中ESCRT系统多个成员Chmp1b、Chmp1a、Tsg101表达的变化,明确Chmp1b/1a在肺组织中的表达模式和与纤维化的相关关系。第二部分SPC-rt TA/tet O7-Cre系统转基因小鼠末梢肺组织AECII分别特异性敲减Chmp1b和Chmp1a,琼脂凝胶电泳、免疫组化等方法鉴定转基因小鼠模型的建立,明确Chmp1b是否对上皮细胞稳态产生影响;腹腔注射博来霉素造模,HE染色、免疫组化、Realtime PCR等方法阐明Chmp1b/1a是否对纤维化产生影响。第三部分采用了SPC-rt TA/tet O7-Cre/m Tm G系统自成体诱导追踪标记气道上皮后裔细胞,免疫组化、免疫荧光等方法分析肺纤维化过程中上皮细胞对于EMT的贡献。第四部分尝试在基础剥离液中添加不同浓度尿素对同一切片剥离抗体进行免疫组化重复染色,选择出最佳方案。野生型小鼠腹腔注射博来霉素造模,利用免疫组织化学抗体剥离重复染色、油红染色和Realtime PCR等方法,阐明脂成纤维细胞标志物ADRP在纤维化过程中的分布情况,与巨噬细胞、成纤维细胞等标志分子共定位情况,了解其与纤维化过程的关系;采用截短流程造模,证实ADRP+细胞与巨噬细胞的类群转换与纤维化过程相关,从而也验证了免疫组化抗体剥离技术的有效性。1.Chmp1b/1a是肺纤维化病程负相关的肺泡上皮细胞标志分子1.1动物分组和肺纤维化模型制备8-12周雄性C57 BL/6小鼠,随机分为正常组和实验组（肺纤维化模型组）,每组6只。第0、2天注射博来霉素40 USP/kg,第4、6天注射20 USP/kg,第9、12、15、18、21、24、27天注射10 USP/kg。实验组第14、21、28天取材。正常对照组注射相同容积的生理盐水。1.2病理标本的制备及HE、Masson染色小鼠右侧肺组织石蜡包埋并切片后,行HE染色、Masson染色。1.3免疫组化染色采用SP法,对右侧肺组织切片标本进行免疫组化染色,检测ESCRT成员Chmp1b/1a在正常小鼠肺组织和纤维化肺组织中的表达分布。1.4抗体剥离重复染色剥离缓冲液65 m M Tris-HCl p H 6.8,1%SDS,0.113 M2-巯基乙醇,0.1 M Na Cl,2 M尿素剥离抗体,同一切片进行免疫组化重复染色,观察正常小鼠肺组织和纤维化肺组织中Chmp1b/1a与SPC、PCNA、Smad2、α-SMA等的共定位情况。1.5 Realtime PCR小鼠左侧肺组织提取RNA,检测各ESCRT成员（Chmp1b、Chmp1a、Tsg101）和纤维化相关重要分子（Collagen、IL-1β、IL-6）的表达水平。2.敲减Chmp1b/1a影响肺AECII分化状态和导致肺纤维化呈加重趋势2.1动物分组和肺纤维化模型制备使用基因型为SPC-rt TA+/-/tet O7Cre+/-转基因小鼠与shcmb+/-基因型小鼠交配,交配成功即使用Doxycyclin诱导,在饮水中添加Doxycyclin至0.5mg/ml,诱导至出生后30天（E0.5-P30）,常规鉴定基因型,选择基因型为SPC-rt TA+/-/tet O7Cre+/-/shcmb+/-的转基因小鼠作为实验组,同窝同性别缺少SPC-rt TA/tet O7-Cre/shcmb三个基因位点中一个的为对照组,饲养至12周龄腹腔注射博来霉素造模,操作者对小鼠基因型未知,腹腔注射博来霉素造模,第0、2天注射博来霉素40 USP/kg,第4、6天注射20 USP/kg,第9、12、15、18、21、24、27天注射10 USP/kg,造模过程中监控体重变化及死亡情况,完成整个造模流程的存活小鼠于造模后第28天取材。同样的实验流程用于Chmp1a的相关研究。2.2病理标本的制备及HE染色小鼠右侧肺组织石蜡包埋并切片后,行HE染色。2.3免疫组化染色采用SP法,对右侧肺组织切片标本进行免疫组化染色,检测纤维化相关指标α-SMA。2.4抗体剥离重复染色剥离缓冲液65 m M Tris-HCl p H 6.8,1%SDS,0.113 M2-巯基乙醇,0.1 M Na Cl,2M尿素剥离抗体,进行同一切片抗体剥离重复免疫组化染色（Cre、Chmp1b/1a）,验证转基因小鼠Chmp1b和Chmp1a敲减。同一切片抗体剥离重复免疫组化染色（Cre、Chmp1b、SPC）,观察Chmp1b敲减对肺泡上皮稳态的影响。2.5琼脂凝胶电泳小鼠左侧肺组织提取DNA,琼脂凝胶电泳验证转基因小鼠Chmp1b/1a敲减。2.6 Realtime PCR小鼠左侧肺组织提取RNA,检测纤维化相关指标Collagen、α-SMA、S100A4、IL-6的表达水平,比较对照小鼠和转基因小鼠造模后的纤维化严重程度。3.细胞追踪显示气道上皮细胞在肺纤维化过程中的转分化命运3.1动物分组和肺纤维化模型制备SPC-rt TA鼠（B6.Cg-Tg（SFTPC-rt TA）5Jaw/J）,tet O7-Cre鼠（B6.Cg-Tg（tet O-cre）1Jaw/J）引自Jacksonlab,m Tm G鼠（B6.129（Cg）-Gt（ROSA）26Sortm4（ACTB-td Tomato,-EGFP）Luo/J）来自南京模式生物研究所,三种小鼠交配获得基因型为SPC-rt TA+/-/tet O-Cre+/-/m Tm G+/-的转基因小鼠,8-12周龄转基因小鼠用Doxycyclin诱导15天,分为对照组、实验组（纤维化模型组）,每组3只。实验鼠隔天腹腔注射博来霉素,第0、2天注射博来霉素40 USP/kg,第4、6天注射20 USP/kg,第9、12、15、18、21、24、27天注射10 USP/kg,正常对照组注射相同容积的生理盐水,第28天取材。3.2免疫组化染色采用SP法,对右侧肺组织切片标本进行免疫组化染色,检测m EGFP在纤维化肺组织的表达。3.3抗体剥离重复染色剥离缓冲液65 m M Tris-HCl p H 6.8,1%SDS,0.113 M2-巯基乙醇,0.1M Na Cl,2 M尿素剥离抗体,同一切片进行免疫组化重复染色（SPC、m EGFP、α-SMA、S100A4）,观察纤维化小鼠上皮细胞的分化状态。3.4免疫荧光m EGFP和PCNA进行免疫荧光,共聚焦荧光显微镜观察纤维化小鼠病变部位上皮细胞的增殖状态。4.免疫组织化学抗体剥离重复染色显示ADRP+CD206+细胞与肺纤维化发生相关4.1动物分组和肺纤维化模型制备8-12周雄性C57BL/6小鼠,实验动物随机分组,按以下两种方式造模。正常流程造模:随机分为5组,正常对照组和实验组（肺纤维化模型组）,每组6只。实验组腹腔注射博来霉素,第0、2天注射博来霉素40 USP/kg,第4、6天注射20 USP/kg,第9、12、15、18、21、24、27天注射10 USP/kg,4组实验组分别第7、14、21、28天随机取材。正常对照组注射相同容积的生理盐水第28天取材。截短流程造模:随机分为6组,正常对照组和实验组（肺纤维化模型组）,每组6只。5组实验组分别腹腔注射博来霉素1次（第0天40 USP/kg）、2次（第0、2天40 USP/kg）、3次（第0、2天注射博来霉素40 USP/kg,第4天注射20 USP/kg）、4次（第0、2天注射博来霉素40 USP/kg,第4、6天注射20 USP/kg）和持续造模（同正常流程造模）,1组正常对照组注射相同容积的生理盐水,均第28天取材。4.2病理标本的制备及HE、Masson染色小鼠右侧肺组织石蜡包埋并切片后,行HE染色、Masson染色,观察不同取材时期和不同注射次数的肺组织变化情况。4.3免疫组化染色采用SP标本法,对右侧肺组织切片进行免疫组化染色,检测ADRP在正常小鼠肺组织和纤维化过程中肺组织的表达分布。4.4抗体剥离重复染色基础剥离缓冲液含65 m M Tris-HCl p H 6.8,1%SDS,0.113M 2-巯基乙醇,0.1M Na Cl,使用时添加不同浓度尿素（0 M、1 M、2 M、4 M、6M）进行抗体剥离,随后进行第二次免疫组化染色,检查剥离效果。选择出最合适尿素浓度,进行重复免疫组化染色,观察不同取材时期和不同注射次数ADRP与巨噬细胞标志物（CD68、CD86、CD206）、S100A4、Caspase9等的共定位情况。4.5 Realtime PCR小鼠左侧肺组织提取RNA,检测脂成纤维细胞标志物（ADRP、PDGFRα）、巨噬细胞标志物（CD68、CD86、CD206）和纤维化相关重要分子（Collagen、α-SMA）的表达水平。研究结果:1.Chmp1b/1a是肺纤维化病程负相关的肺泡上皮细胞标志分子1.1 Chmp1b/1a主要分布于末梢肺组织Ⅱ型肺泡上皮细胞以及近端气道上皮细胞中。在末梢肺组织,Chmp1b/1a的表达模式与传统的Ⅱ型肺泡上皮细胞标志分子SPC高度重合。1.2造模诱导肺纤维化过程中,Realtime PCR检测到Chmp1b/1a表达水平逐渐降低。高表达α-SMA的纤维化病灶区有许多PCNA阳性细胞,但不表达Chmp1b/1a,并且纤维化病灶相邻的Chmp1b+细胞中Chmp1b的染色强度低于远离病灶区的Chmp1b+细胞,而SPC在病灶临近区以及远离病灶区染色强度相似。1.3造模组小鼠末梢肺组织结构正常区域许多细胞核中表达Smad2,多数同时表达Chmp1b。而对照组肺组织未见明显的Smad2表达。2.敲减Chmp1b/1a影响肺AECII分化状态和导致肺纤维化呈加重趋势2.1 SPC-rt TA/tet O7-Cre系统末梢肺组织AECII特异性敲减转基因小鼠成功建立。小鼠鼠尾DNA凝胶电泳显示正确的重组质粒酶切片段,免疫组化重复染色提示Cre阳性表达的肺泡Ⅱ型上皮细胞中Chmp1b阳性表达细胞降低。2.2 Chmp1b敲减后对肺泡上皮稳态产生影响,敲减Chmp1b的AECII细胞中SPC表达降低。2.3Chmp1a敲减转基因小鼠经腹腔注射博来霉素造模后死亡率增加,Chmp1b敲减转基因小鼠造模后纤维化指标有上升趋势。3.细胞追踪显示气道上皮细胞在肺纤维化过程中的转分化命运3.1 SPC-rt TA鼠（B6.Cg-Tg（SFTPC-rt TA）5Jaw/J）,tet O7-Cre鼠（B6.Cg-Tg（tet O-cre）1Jaw/J）,m Tm G鼠（B6.129（Cg）-Gt（ROSA）26Sortm4（ACTB-td Tomato,-EGFP）Luo/J）,三种小鼠交配成功获得基因型为SPC-rt TA+/-/tet O-Cre+/-/m Tm G+/-的标记上皮细胞的转基因小鼠,抗体剥离重复染色技术可以用于细胞的追踪定位研究。3.2造模小鼠肺组织中,在纤维化病灶区存在m EGFP+细胞,观察到少数细胞存在α-SMA、S100A4和m EGFP共定位,但并不是纤维化病灶的主体。3.3造模小鼠肺组织中,在纤维化病灶区存在的多数m EGFP+细胞不与PCNA共定位。4.免疫组织化学抗体剥离重复染色显示ADRP+CD206+细胞与肺纤维化发生相关4.1免疫组织化学抗体剥离重复染色,基础剥离缓冲液含65 m M Tris-HCl p H6.8,1%SDS,0.113 M 2-巯基乙醇,0.1 M Na Cl,使用时添加不同浓度尿素（2 M、4 M、6 M）,尿素浓度2 M时可以获得最佳的抗体剥离效果。4.2腹腔注射博来霉素诱发小鼠肺纤维化发生过程中,不同时期和不同给药次数取材,脂成纤维细胞标志物ADRP的m RNA表达水平持续升高,但PDGFRα的m RNA表达水平降低。4.3造模早期肺组织中ADRP+细胞包括脂成纤维细胞和巨噬细胞（主要是M1型）;后期ADRP+细胞基本为巨噬细胞（M2型）。这种ADRP+细胞M1/M2类群转换发生在正常流程造模14天取材或截短流程造模给药3次28天取材。4.4 ADRP+细胞类群转换发生时期,ADRP+CD206+细胞主要分布在α-SMA和N-cadherin阳性表达区域附近。ADRP+CD206+细胞富集区AEC表达Caspase-9较多,提示这是肺泡上皮损伤区域。4.5在纤维化过程中,ADRP与S100A4共定位的比例逐渐升高。不同时期均与Caspase9共定位,但与PCNA无共定位关系。结论:1.正常小鼠末梢肺组织中,Chmp1b/1a可以作为Ⅱ型肺泡上皮细胞的标记分子。腹腔注射博来霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织中,Chmp1b/1a、Tsg101表达模式与肺纤维化病变过程存在负相关性,提示ESCRT系统可能在肺纤维化病变中起重要的作用。2.SPC-rt TA/tet O7-Cre系统末梢肺组织AECII特异性敲减Chmp1b/1a转基因小鼠成功建立。Chmp1b敲减后导致了AECII的SPC降低,影响了肺泡上皮细胞的分化。Chmp1a敲减转基因小鼠经腹腔注射博来霉素造模后死亡率有增加趋势,Chmp1b敲减转基因小鼠造模后纤维化指标有上升趋势。3.SPC-rt TA/tet O7-Cre/m Tm G系统自成体诱导成功标记小鼠上皮细胞,抗体剥离重复染色技术可以用于细胞的追踪定位研究,造模小鼠在纤维化病灶区存在m EGFP阳性细胞,并观察到少数上皮细胞发生EMT,但大多数细胞不呈增殖状态,说明EMT并不是纤维化病灶的主体。4.免疫组化抗体剥离重复染色技术可以用于细胞的共定位研究。造模小鼠肺纤维化发生过程中,脂成纤维细胞标志物ADRP的m RNA表达水平持续升高,但PDGFRα表达水平降低。通过共定位方法,发现造模早期肺组织中ADRP+细胞包括脂成纤维细胞和巨噬细胞（主要是M1型）;后期ADRP+细胞基本为巨噬细胞（M2型）,该过程与肺纤维化病变发生相关,ADRP阳性M2极化的巨噬细胞聚集部位预示着纤维化损害即将或者已经发生。