肿瘤微环境在癌症的发生、发展以及转移过程中发挥着异常重要的作用。PGE2是一类炎症因子,参与形成肿瘤部位免疫抑制性微环境。研究表明,EP4作为PGE2下游重要的功能受体,能够通过影响多种免疫细胞的功能进而促进肿瘤的的发生发展。因此,筛选新型EP4受体拮抗剂用于肿瘤免疫治疗具有极大的前景。本研究利用钙流实验筛选了一系列小分子化合物,从中得到一个候选化合物YJ-4-8。多个细胞功能实验进一步表明,YJ-4-8能够有效抑制EP4受体相关的信号通路,如c AMP的积累(IC50=18.7±0.6 n M),CRE报告基因的表达(IC50=5.2±0.4 n M)及ERK1/2的活化。同时,YJ-4-8对于EP4受体具有高选择性,对其它EP受体无抑制活性。竞争性实验表明YJ-4-8是一个PGE2竞争性拮抗剂。在体外Raw264.7细胞诱导实验中,YJ-4-8能够显著下调由PGE2引起的多个免疫抑制相关基因（IL-6、IL-1β以及ARG1等）的表达,缓解了免疫抑制状态。鉴于PGE2-EP4在肠癌中异常活化的状态,我们利用小鼠结肠癌细胞CT-26建立了同源移植瘤模型,发现YJ-4-8能够有效地抑制肿瘤的生长,且给药处理后不影响小鼠体重。细胞毒性实验说明YJ-4-8在多种细胞上并无毒性(IC50>100μM),提示化合物的抑制肿瘤作用并非通过直接杀伤肿瘤细胞。我们进一步分析了肿瘤部位浸润的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,实验结果显示对比Control组,YJ-4-8处理组中肿瘤部位CD8+T（CD45+CD8+）细胞的浸润显著增加。在免疫荧光实验中也同样观察到YJ-4-8处理组肿瘤组织中CD8+T细胞的数量明显增多,提示机体的抗肿瘤免疫能力增强。综上所述,YJ-4-8是一个高活性且特异的新型EP4受体拮抗剂,并且能够通过增加CD8+T细胞的浸润,从而增强抗肿瘤免疫反应抑制肿瘤的生长。本研究揭示了EP4小分子拮抗剂在临床前研究中具有良好的抗肿瘤活性,为EP4受体拮抗剂用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。β-arrestin作为GPCRs信号通路中一类关键的转运和调节蛋白,它的招募可以反映GPCRs的活化状态,用于GPCRs配体的活性检测。本研究还成功构建了两个基于EP4/β-arrestin相互作用的实验体系:Tango arrestin实验和Nano Bit蛋白相互作用实验。通过这两个实验体系验证了YJ-4-8能够抑制PGE2诱导的EP4受体对β-arrestin的招募。该体系可以应用于其它GPCRs,有利于后续GPCRs的配体活性检测。