大豆是重要经济作物，根瘤共生固氮直接影响大豆的正常生长以及产量，因此，大豆结瘤和生物固氮一直是植物学中的重大研究课题。但是，由于大豆基因组复杂，测序工作2010年刚刚完成，遗传转化困难等问题，至今我们对大豆共生固氮调控的分子机制还知之甚少。miRNA是一类长度只有21-24nt，在转录后水平调控生物生长发育和逆境响应的非编码小分子RNA。最近在根瘤菌侵染的根和根瘤中都发现了miRNA，其中几个miRNA过表达后改变了根瘤的数量，但这些miRNA如何调控根瘤发育，是否影响固氮效率也未见报道。miR172是一个保守的miRNA家族，在拟南芥中通过靶向AP2和AP2-Like基因在花器官发育、开花时间以及时序转换过程中发挥重要的调控作用。本实验室前期基因表达和Solexa数据结果发现大豆miR172c在功能根瘤中的表达量很高，推测miR172c可能在根瘤发育和固氮效率调控中发挥重要作用。　　 在本研究中，首先利用启动子连接GUS报告基因对miR172c在组织化学水平的表达模式做了分析，发现miR172c在根中柱鞘、皮层、表皮和根毛均有表达，其中在中柱鞘和表皮中表达量相对较高；在幼瘤和成熟根瘤中的表达主要在中央的类菌体细胞中。在侵染前以及侵染后1、3、7、14、18和21天的大豆根组织中，miR172c在根瘤菌侵染后表达上调，侵染后14天达到最高峰后表达量下调。在此期间，miR172c在侵染后根瘤原基分裂分化形成根瘤的关键时期(侵染后3天到7天)的表达量变化最大，说明miR172c可能在根瘤原基的分裂分化过程中发挥重要的功能。进一步转基因研究结果发现，过表达miR172c导致大豆根系结瘤密度显著加大，根瘤数目比对照增加平均2.2倍。　　 为了更深入的研究miR172c在根瘤发育中的功能，通过生物信息学预测以及5RACE验证，确定了5个miR172c的靶基因，并对5个靶基因的组织表达模式以及启动子的顺式作用元件做了分析，推测glymal2g07800很可能作为miR172c一个重要靶基因介导其对根瘤发生及数量的调控，并暂时命名为GmNNC1(Nodule NumberControl1)。对pGmNNC1：：GUS转化根及根瘤染色分析显示，该基因在根中主要分布在中柱中，但是根瘤菌侵染后，其表达在表皮、根毛中也有表达。过表达miR172c的转基因根中GmNNC1的表达水平明显降低，说明miR172c在mRNA水平调控该基因。非常重要的是，GmNNC1基因的RNAi转基因毛状根的根瘤的密度和数目也大幅度增加(平均是对照的1.7倍)，比miR172c过表达后对结瘤的影响要稍低。这些结果说明GmNNC1基因是miR172c调控结瘤过程的最主要的靶基因，但不是唯一的靶基因。　　 NFR1(Nod-Factor Receptor1)和NFR5作为结瘤因子受体参与豆科植物对结瘤因子的响应，在调控大豆根系结瘤和根瘤数量中起关键作用。为了探讨miR172c是否参与NFR介导的根瘤发生的信号途径，我们在NFR1α和NFR5α功能缺失突变体nod49和nod139根瘤菌侵染后6天的根和叶片中检测miR172c的表达，发现在根组织中miR172c在nod49和nod139的表达相对野生型分别下调了28％和72%，在叶组织中，miR172c在nod49中的表达相对野生型下调了38%，而nod139的叶片中miR172c几乎不表达。表明miR172c在根瘤菌侵染后的诱导表达受NFR基因调控，尤其是NFR5α基因。　　 土壤中的氮素水平和根瘤的共生固氮过程具有相互拮抗的作用，为了分析miR172c对结瘤的调控是否受到氮素水平的影响，我们对不同氮素水平下miR172c的表达进行了分析。结果显示，在根组织中，miR172c在野生型Bragg中低氮与正常氮条件下的表达量没有变化，对低氮不响应。在突变体nod49和nod139中低氮处理下相对于正常氮处理分别下调了33%和48%；在叶组织中，miR172c在Bragg中低氮条件下表达水平上调了90倍，而在nod49中表达水平只上调了4.4倍，在nod139中表达量反而下调至正常氮条件下的6%。这表明miR172c对低氮的响应发生在叶片中，而且这种响应是依赖NFR，尤其是NFR5α基因的。　　 从上述研究可以发现miR172c是大豆结瘤过程的一个非常重要的调控因子，它受结瘤因子受体NFR基因调控，并主要通过负向调控靶基因GmNNC1，影响结瘤的密度和数量。这些研究结果对于丰富我们对大豆miRNA功能的认识，尤其是对miRNA调控大豆结瘤的分子机制的深入了解具有很重要的意义。