【摘 要】
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沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）是一种古老的光合细菌,其菌体富含核黄素、5-氨基乙酰丙酸（ALA）、胞外多糖（EPS）、胞外蛋白和酰基丝氨酸内酯（AHL）等多种生物活性因子,被广泛应用于食品、畜牧、环境治理和农业等领域。研究证明,RhpPSP作为沼泽红假单胞菌的一种胞外蛋白,RhpPSP蛋白不仅对TMV病毒粒子有直接抑制作用,还能诱导烟草对TMV产生抗性。为进
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沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）是一种古老的光合细菌,其菌体富含核黄素、5-氨基乙酰丙酸（ALA）、胞外多糖（EPS）、胞外蛋白和酰基丝氨酸内酯（AHL）等多种生物活性因子,被广泛应用于食品、畜牧、环境治理和农业等领域。研究证明,RhpPSP作为沼泽红假单胞菌的一种胞外蛋白,RhpPSP蛋白不仅对TMV病毒粒子有直接抑制作用,还能诱导烟草对TMV产生抗性。为进一步研究RhpPSP的诱导抗病机制,本试验利用酵母双杂交系统筛选了RhpPSP蛋白在烟草内的互作蛋白,并通过VIGS基因沉默技术对互作蛋白进行了初步功能验证,最后通过体内、体外等多种手段对互作关系进行了进一步验证,主要结果如下:1.酵母双杂交实验表明,构建的酵母诱饵载体对酵母细胞无毒性且无自激活活性,通过与烟草c DNA文库杂交、筛选并鉴定出了11种与RhpPSP互作的蛋白,其中涉及到叶绿素结合、光系统稳定、维管束发育等多种生物学过程。将11个蛋白分别与RhpPSP进行一对一的酵母回复验证,最终确定了NbGPI1蛋白、VAN3结合蛋白及Cab10A叶绿素结合蛋白与RhpPSP的互作。2.为了探明筛选出的3个蛋白与RhpPSP互作与诱导抗病的相关性,通过病毒介导的基因沉默获得了NbGPI1、VAN3及Cab10A沉默植株。RhpPSP处理后接种TMV-GFP病毒,结果发现NbGPI1沉默植株TMV症状较为严重,且q PCR结果显示累积的TMV含量显著高于其余实验组,表明RhpPSP处理后NbGPI1沉默植株对TMV的抗病性减弱。3.通过GST-pull down、CO-IP、BIFC等对RhpPSP与NbGPI1的互作进行进一步验证。在GST-pull down实验中,His-NbGPI1融合蛋白能被GST-RhpPSP下拉,并能够用His抗体检测到,说明NbGPI1能够与RhpPSP互作;在CO-IP实验中,经过GFP磁珠处理后洗脱的样品中HA-NbGPI1同样能被HA抗体检测到,表明了互作关系;在BIFC实验中,在烟草的细胞质膜上观察到黄色荧光,证明RhpPSP与NbGPI1存在特异性互作,且互作位点位于细胞质膜上。
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