南极磷虾(Euphausia superba)抑菌活性肽的初步纯化及其作用机理研究

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南极磷虾(Euphausia superba)是南极生态系统的关键物种,不但资源巨大,而且营养价值丰富具有高蛋白、低脂肪等特点,因而对该资源其高值化利用具有重要意义。本文以南极磷虾为研究对象,通过双酶酶解制备南极磷虾抑菌活性肽混合物,并对酶解工艺条件进行优化;采用Labscale小型切向流超滤系统、MSC300超滤杯和CM-52Carboxymethyl Cellulose阳离子交换层析对南极磷虾抑菌活性肽混合物进行初步纯化,并探讨了其抑菌机理。主要研究结论如下:1、南极磷虾蛋白酶解物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有明显的生长抑制作用,最佳酶解工艺为中性蛋白酶和胰蛋白酶双酶水解,最适pH7.5,温度52.5℃,水解时间3h,双酶加酶量之比为2:5(w:w),双酶添加量为3000U/g底物。2、南极磷虾抑菌活性肽混合物经超滤、弱阳离子交换层析纯化后最终得到一个分子量范围在254-709D的混合肽(命名为CMCC-1),其最低抑菌浓度(MIC)为5mg/mL。3、抑菌机理研究结果表明:①CMCC-1在对数生长期能抑制金黄色葡萄球菌的菌体分裂;②培养液中蛋白和还原糖含量提高、电导率增加,且能检测到碱性磷酸酶和p-半乳糖苷酶的活性,说明菌体细胞壁和细胞膜可能被破坏,致使菌体通透性增强,大量胞内物质外泄;③经过扫描电镜对金黄色葡萄球菌菌体形态结构观察发现,随着CMCC-1处理时间的延长,加样组金黄色葡萄球菌菌体细胞形状变得不规则,菌体细胞表面粗糙,体积变小,大量的菌体细胞粘连在一起,大量胞内物质外溢,细胞之间的界限变得模糊不清,几乎融合为一个整体;④透射电镜下观察到,经CMCC-1处理后,金黄色葡萄球菌菌体表面变粗糙,细菌的繁殖能力受到抑制,菌体细胞壁变薄、细胞质固缩,内部空腔变大,菌体内含物大量外泄,不规则地分布在破碎菌体周围,菌体细胞最终裂解、死亡;⑤经SDS-PAGE分析,CMCC-1可导致菌体全蛋白谱带中部分谱带的缺失,剩余蛋白谱带也随着CMCC-1处理时间的延长而逐渐变浅。⑥基因组DNA电泳结果显示,经CMCC-1处理的金黄色葡萄球菌菌体基因组DNA条带虽没有呈弥散状,但亮度明显降低。根据以上实验结果推钡(?)CMCC-1对金黄色葡萄球菌的抑制作用机理是破坏了菌体细胞壁和细胞膜,改变了细胞膜的通透性,导致大量胞内物质外泄,从而引起菌体死亡。
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