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第一部分 hnRNPA1在脑出血后的蛋白水平及分布变化目的:研究大鼠脑出血(ICH)后脑组织中hnRNPA1的蛋白表达水平及其分布的变化。方法:(1)将48只SD大鼠随机平均分配到以下8组:假手术组和7个不同时间点的ICH亚组,即脑出血后3h、6h、12h、24h、48h、72h、7d组,每组6只大鼠。在对应时间点麻醉后处死大鼠,取大鼠血肿周围脑组织进行Western blot分析和免疫荧光染色来检测hnRNPA1的蛋白水平及分布情况。(2)根据前一步骤结果,将12只大鼠随机分配分到假手术组和ICH 48 h组,每组6只大鼠。在造模后48小时后处死大鼠,取大鼠血肿周围脑组织,分离提取核蛋白与胞浆蛋白,再通过Western blot分析分别检测hnRNPA1在细胞核和细胞质中的蛋白表达水平。结果:1、大鼠脑出血(ICH)后脑组织内的hnRNPA1总的蛋白水平在大鼠脑出血后3小时内成上升趋势,3小时到6小时hnRNPA1表达短暂下降,6小时至48小时hnRNPA1蛋白水平再次呈上升趋势,48小时至7天hnRNPA1蛋白水平呈下降趋势,并且hnRNPA1的蛋白表达在大鼠脑出血后48小时到达峰值。(P<0.01)2、大鼠脑出血(ICH)后细胞核内的hnRNPA1蛋白水平呈下降趋势,而细胞质内hnRNPA1蛋白水平呈上升趋势。(P<0.01);3、体内免疫荧光结果显示hnRNPA1主要定位于细胞核,但在脑出血后48小时细胞质的定位明显升高;结论:脑出血(ICH)后hnRNPA1总蛋白表达水平升高,并且hnRNPA1在脑出血后由神经元的细胞核内向细胞质内转移。第二部分 HnRNPA1在脑出血后继发性脑损伤中的作用目的:通过hnRNPA1质粒和hnRNPA1小干扰RNA干预后上调或下调hnRNPA1在脑出血后细胞内的表达,探索hnRNPA1表达变化后对大鼠脑出血后继发性脑损伤的影响。方法:将108只大鼠随机平均分为以下6组:假手术组、ICH组、ICH+vector组、ICH+Over-hnRNPA1 组、ICH+CtrsiRNA 组、ICH+hnRNPA1 siRNA 组,每组 18只。在转染hnRNPA1质粒与小干扰RNA后48小时建立脑出血模型。从每组中随机选取6只用于水迷宫试验,并按照建模后时间点1天、3天、5天进行。剩余大鼠在造模后48小时处死前进行行为学评分,评分后麻醉并处死大鼠,取血肿周围脑组织,进行Western blot分析及FJB和TUNEL染色。结果:1、使用hnRNPA1质粒过表达可使其在脑组织内表达升高,而经hnRNPA1小干扰RNA干预后hnRNPA1表达下降。(P<0.05)2、根据体内实验TUNEL染色、FJB染色结果显示过表达hnRNPA1可减少脑出血后继发性脑损伤中神经元细胞的凋亡、坏死,下调hnRNPA1表达可加重神经元细胞的凋亡、坏死。(P<0.05)3、动物神经行为学评分及水迷宫试验结果显示过表达hnRNPA1可改善大鼠脑出血后的神经行为学功能和学习记忆力,下调hnRNPA1的表达会减弱大鼠脑出血后的神经行为学功能和学习记忆力。(P<0.05)结论:HnRNPA1在大鼠脑出血后诱导的继发性脑损伤中起保护性作用。上调hnRNPA1水平能很大程度缓解脑出血的继发性脑损伤,而下降hnRNPA1水平加重脑出血的继发性脑损伤。第三部分 HnRNPA1在脑出血后继发性脑损伤中发挥保护性作用的机制研究目的:通过hnRNPA1质粒和小干扰RNA的干预后通路相关的各蛋白水平变化,推断出HnRNPA1在脑出血后继发性脑损伤中发挥保护性作用的潜在的机制。实验方法:(1)将36只SD大鼠随机平均分配到以下6组:假手术组、ICH组、ICH+vector 组、ICH+Over-hnRNPA1 组、ICH+CtrsiRNA 组、ICH+hnRNPA1 siRNA组,每组6只。在转染hnRNPA1质粒与小干扰RNA后48小时建立脑出血模型。在造模后48小时处死相应组大鼠,取血肿周围脑组织,进行qPCR分析Bcl-xl mRNA的变化趋势。(2)利用第二部分实验样品,对假手术组、ICH组、ICH+vector组、ICH+Over-hnRNPA1 组、ICH+CtrsiRNA 组、ICH +hnRNPA1 siRNA 组进行 Western blot分析Bcl-xl的变化趋势。结果:1、过表达hnRNPA1 可增加脑出血后Bcl-xl mRNA的表达,抑制hnRNPA1的表达可减少Bcl-xl mRNA的表达。2、过表达hnRNPA1可增加脑出血后Bcl-xl的表达,抑制hnRNPA1的表达可减少Bcl-xl的表达。结论:HnRNPA1可通过调控Bcl-xl起到改善大鼠脑出血后继发性脑损伤的作用,可作为ICH后继发性损伤的潜在治疗靶点和研究方向。