论文部分内容阅读
石斑鱼是生长在中国东南部及东南亚地区的一种肉质鲜美，经济价值高的鱼类。但是由于养殖规模的扩大和环境的恶化，频繁爆发的病害，对石斑鱼造成严重的经济损失。虹彩病毒SGIV(Singapore Grouper Iridovirus)和神经坏死病毒NNV(Nervous Necrosis Virus)是对石斑鱼养殖产业威胁最大的病原性病原。挖掘和鉴定石斑鱼抗病功能基因为石斑鱼病害防控提供新的策略。目前已经克隆鉴定到多种石斑鱼抗病基因，包括LGP2，MDA5，STAT3，IRF3等。鉴于TBK1(TANK-binding kinase-1)和TRIM29(Tripartite Motif Protein29)基因在诱导宿主免疫反应中发挥重要作用，本论文选择石斑鱼TBK1和TRIM29L研究它们的抗病毒功能，取得的研究结果如下: 1.石斑鱼TBK1的克隆与功能研究:从石斑鱼(Epinephelus coioides))中克隆出到TBK1(EcTBK1)全长，序列分析显示EcTBK1编码723个氨基酸，与大黄鱼(Larimichthys crocea))和人类(homo sapiens)分别有98％和73％的基因序列相似性。多重氨基酸序列比对显示EcTBK1包含3个保守结构域:N端激酶结构域，中间的泛素化结构域，C端的卷曲螺旋。组织分布分析表现EcTBK1分布于所有组织中，尤其在小肠里表达量最高。体外感染表现RGNNV和SGIV感染能明显上调EcTBK1的表达，表示EcTBK1在鱼类病毒感染中起重要作用。亚细胞定位显示EcTBK1主要分布于GS细胞的细胞质中。EcTBK1的过表达能显著抑制RGNNV和SGIV的病毒复制。同时EcTBK1的过表达还能明显提高干扰素相关基因和促炎症因子的表达水平。此外，EcTBK1的过表达能提高IRF3和IRF7调节的干扰素启动子活性。总之，研究结果表明EcTBK1能通过调节干扰素免疫反应和炎症反应来发挥它的抗病毒功能。 2.石斑鱼TRIM29L的克隆与功能研究:EcTRIM29L全长包含1527个碱基，EcTRIM29L与大黄鱼，斑马鱼和罗非鱼中的TRIM29基因分别由86％，84％和83％的序列相似性。EcTRIM29L包含B1-B2-CC结构域，却缺少RING结构。进化树显示EcTRIM29L与大黄鱼和斑马鱼的亲缘关系最近。EcTRIM29L在肝和鳃中表达含量最高。EcTRIM29L在RGNNV和SGIV感染过程中表达水平显著升高，分别在感染后18h和36h时达到最高点。亚细胞定位分析显示EcTRIM29L在细胞质中呈点状分布。与对照组相比，EcTRIM29L过表达细胞中SGIV引起的CPE进程和RGNNV引起的空泡均明显减少，同时SGIV的三个病毒基因MCP，VP19和ICP-18以及RGNNV的两个病毒基因CP和RdRp的表达量均明显降低。EcTRIM29L的过表达显著上调干扰素相关基因和炎症因子的表达水平，同时荧光素酶报告基因实验结果进一步评估了EcTRIM29L在干扰素信号通路中的作用，发现EcTRIM29L对干扰素免疫反应的激活依赖于IRF3和IRF7这两个转录调节因子。总之，EcTRIM29L是一种强效的抗病毒基因，并且主要通过上调依赖于IRF3和IRF7介导的干扰素反应发挥抗病毒作用。