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研究背景糖尿病是一种常见的慢性疾病,因其发病率高,并发症对机体损伤严重,已成为世界第三大非传染性疾病,患者中约90%以上为2型糖尿病患者。目前治疗2型糖尿病的药物包括化学药物和生物药物两大类,都存在安全性和高效性不理想等问题。基因治疗诞生于上世纪70年代,历经50年发展。随着新病毒载体的成熟运用、载送方式的不断改进及治疗思路的不断扩展,运用基因治疗技术治疗2型糖尿病越来越受到重视。胰高血糖素样肽-1（Glucagon-likepeptide-1,GLP-1）是一种重要的肠道内分泌激素,具有降低过高血糖、促进胰岛素分泌、刺激胰岛β细胞增殖、抑制胰高血糖素分泌、降低胰岛素抵抗、延缓胃排空、抑制食欲、保护心血管和神经系统等作用,因其具备理想降糖药的多种特征,目前已成为糖尿病治疗药物研究领域的研发热点。天然GLP-1极易被二肽基肽酶（Dipeptidyl-peptidase Ⅳ,DPP-4）剪切其活性位点,GLP-1在体内的半衰期极短,约2 min,因此限制了其临床应用。为了促使GLP-1具有成药性,研究者开始关注对GLP-1进行改造和修饰。人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）不仅可以分化为IPC降低糖尿病动物的血糖,还可抑制免疫系统对胰岛细胞的损伤和减轻胰岛素抵抗,无免疫排斥和伦理道德问题,是理想的药物载体。本项目拟以hUC-MSCs作为药物载体,荷载GLP-1腺病毒基因,应用2型糖尿病模型验证其治疗2型糖尿病活性及机制。研究目的通过基因工程技术延长GLP-1在机体内的半衰期,发挥GLP-1与hUC-MSCs协同抗2型糖尿病作用,为开发新型抗2型糖尿病药物提供新的思路和方法,为基因治疗2型糖尿病提供理论支持。研究方法1.制备2型糖尿病模型小鼠利用链脲佐菌素联合高脂高糖饮食方法,制备2型糖尿病模型小鼠。观察并比较摄食量、饮水量和体重变化;HK法检测小鼠血清中血糖水平;ELISA法检测小鼠血清中胰岛素水平,计算HOMA-IR值;O2K能力代谢分析系统检测小鼠胰腺线粒体功能;HE法评价小鼠胰腺病理变化。2.GLP-1修饰hUC-MSCs活性分析显微镜观察GLP-1转染对hUC-MSCs形态影响;q-PCR法检测转染后细胞内GLP-1 mRNA表达量;ELISA法检测肌注GLP-1基因修饰细胞后小鼠血清中GLP-1含量;观察肌注GLP-1基因修饰细胞后小鼠体重和摄食量变化。3.GLP-1修饰hUC-MSCs降糖效果研究HK法检测小鼠血清中血糖变化;ELISA法检测小鼠血清中胰岛素水平,计算HOMA-IR值;糖耐量实验检测小鼠对葡萄糖利用情况;胰岛素耐量实验检测小鼠对胰岛素的敏感度。4.GLP-1修饰hUC-MSCs降糖机制研究O2K能量代谢分析系统检测小鼠胰腺线粒体功能;Western blot检测胰腺中CHOP、GRP-78和SXBP-1蛋白表达;ELISA法检测小鼠血清中胰高血糖素水平;HE染色观察小鼠胰腺病理变化。研究结果1.与正常组比较,模型组体重变化不明显（p>0.05）;摄食量和饮水显著增加（p<0.01）;空腹血糖值显著提高（p<0.01）;血清中胰岛素含量显著降低（p<0.01）,同时HOMA-IR值增高（p<0.01）;胰腺线粒体最小呼吸耗氧量无统计学差异（p>0.05）;最大呼吸耗氧量降低（p<0.05）;基础呼吸量差异性显著（p<0.01）;ADP刺激后模型组耗氧量低于正常组（p<0.01）,与ADP刺激无关的耗氧量,模型组远高于正常组（p<0.01）;模型组呼吸控制率显著降低（p<0.01）;ADP:O值降低（p<0.01）;HE观察显示,模型组胰腺结构变化明显。2.GLP-1修饰hUC-MSCs后,光学显微镜观察,细胞形态未见异常;q-PCR结果显示,基因工程构建的AD-GLP-1中GLP-1 mRNA表达量增高（p<0.01）;肌肉注射AD-GLP-1细胞（1×106个/ml）后,小鼠血清中GLP-1含量显著升高（p<0.01）;同时小鼠的摄食量（p<0.01）和体重降低（p<0.01）;而对照组AD-GFP无变化（p>0.05）。3.与模型组比较,给予AD-GLP-1 3周后,小鼠体重显著降低（p<0.01）;摄食量减少（p<0.01）;空腹血糖值显著降低（p<0.01）;空腹胰岛素值显著升高（p<0.01）;HOMA-IR值显著降低（p<0.01）;胰岛素抵抗AUC显著降低（p<0.01）;糖耐量实验AUC显著降低（p<0.01）。4.与模型组比较,给予AD-GLP-1 3周后,小鼠胰腺线粒体最小呼吸耗氧量无明显变化（p>0.05）;最大呼吸耗氧量升高（p<0.05）;基础呼吸耗氧量显著升高（p<0.01）;ADP刺激后耗氧量显著高于模型组（p<0.01）,与ADP刺激无关的耗氧量,远低于模型组（p<0.01）。呼吸控制率AD-GLP-1组显著升高（p<0.01）,ADP:O值显著升高（p<0.01）;膜电位水平显著升高（p<0.01）;活性氧生产速率显著降低（p<0.01）;胰腺中SXBP-1、GRP-78和CHOP表达较模型组显著降低（p<0.01）;胰高血糖素水平显著降低（p<0.01）;HE结果显示,2型糖尿病小鼠胰腺形态改善。研究结论利用基因工程技术,制备GLP-1基因修饰hUC-MSCs。将其肌注2型糖尿病模型小鼠后,模型小鼠的空腹血糖值降低,空腹胰岛素水平升高,HOMA-IR降低,胰岛素耐量和葡萄糖耐量改善,体重和摄食量降低,表现出理想的抗2型糖尿病效果;其降糖机制可能是通过增强胰腺线粒体呼吸能力,改善线粒体功能,调节2型糖尿病小鼠胰腺线粒体ER应激相关的3种蛋白,进而增加体内胰岛素水平,降低胰高血糖素水平,从而改善2型糖尿病小鼠的血糖和胰岛素抵抗。