【摘 要】
：
目的:以蓝藻生物钟蛋白Kai A与Kai C相互作用的结构为基础,结合燕麦LOV2结构域的光控特征,设计一系列的光控Kai A蛋白。根据蛋白质相互作用的特点,筛选合适的光控Kai A蛋白建立光调控的人造生物钟模型。方法:(1)利用PDB数据库检索蓝藻PCC7942 Kai A和燕麦LOV2的氨基酸序列和三维结构。软件分析Kai A的α5螺旋与LOV2的Jα螺旋结构的相似性。选取Jα螺旋的目标突变位
论文部分内容阅读
目的:以蓝藻生物钟蛋白Kai A与Kai C相互作用的结构为基础,结合燕麦LOV2结构域的光控特征,设计一系列的光控Kai A蛋白。根据蛋白质相互作用的特点,筛选合适的光控Kai A蛋白建立光调控的人造生物钟模型。方法:(1)利用PDB数据库检索蓝藻PCC7942 Kai A和燕麦LOV2的氨基酸序列和三维结构。软件分析Kai A的α5螺旋与LOV2的Jα螺旋结构的相似性。选取Jα螺旋的目标突变位点,增加两者结构的相似性。将LOV2与Kai A融合,利用LOV2的Jα螺旋代替Kai A的α5螺旋,并调整连接部位的氨基酸序列。(2)利用NCBI数据库检索LOV2的基因序列。使用Ap E软件对Jα螺旋进行突变设计,通过PCR引物进行基因序列突变并构建p ET-28a-LOV2-Kai A原核表达质粒。(3)将测序正确的原核表达质粒p ET-28a-LOV2-Kai A及p GEX-6P-1-Kai A180C/Kai C转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行目的蛋白的表达。利用亲和层析、离子交换、尺寸排阻等技术进行目的蛋白的纯化。通过SDS-PAGE鉴定目的蛋白的纯度。(4)利用SDS-PAGE和荧光酶标仪检测Kai A180C、Kai C的活性以及LOV2-Kai A融合蛋白的光活性。(5)将LOV2-Kai A及突变型蛋白与Kai C共反应,SDS-PAGE检测Kai C磷酸化状态,分析融合蛋白与Kai C的作用能力。(6)通过蓝光作用筛选光控融合蛋白,利用筛选出的蛋白建立蓝光调控模型。结果:(1)设计了四种类型的光调控模型,成功构建了p ET-28a-LOV2-Kai A及突变型原核表达质粒。(2)成功纯化得到高纯度的Kai C、LOV2-Kai A及突变型蛋白。表达纯化获得的目的蛋白具有良好的活性。(3)LOV2-Kai A及突变体蛋白均能刺激Kai C发生磷酸化并产生分子内的相互作用。(4)利用蓝光筛选出了光控融合蛋白并建立了光调控模型。结论:在本研究中,已设计并成功构建了p ET-28a-LOV2-Kai A及突变型原核表达质粒。通过目前的纯化方法能得到高纯度的LOV2-Kai A及突变型蛋白。体外活性检测表明,LOV2-Kai A及突变型蛋白保留了LOV2的光控活性和Kai A的功能活性。蛋白质相互作用分析显示,通过氨基酸突变增加LOV2的Jα螺旋与Kai A的α5螺旋两者结构的相似性,能增加两者功能的相似性。通过蓝光筛选的LOV2-Kai A蛋白能用于建立光调控的人造生物钟模型。
其他文献
沥青混合料路面结构已经基本成为了高速公路及其他各个等级公路的主要路面结构形式。但随着更大规模的公路建设,养护和维修所带来的废料问题也逐渐增多。因此近年来,沥青混合料再生技术越来越得到重视,并且实际工程中已经开展了再生路面的铺筑。在理论和室内试验的基础之上,再生技术已经得到了进一步的实际运用。对于回收旧沥青和RAP料再生的级配设计已经相对成熟,因此对于再生技术在实际工程中路用性能表现就显得极其重要。
畜肉和畜肉制品是人类获取优质蛋白质的重要来源,其中肌原纤维蛋白(Myofibrillar proteins,MP)占肌肉蛋白质约50%～55%。目前,老龄人群及患病人群由于机体衰老,导致机体功能衰退从而对肉制品摄入困难,这在很大程度上限制了老龄人口及患病人群对畜肉蛋白的获取。本研究以羊肉中的肌原纤维蛋白为原料,先酶解后用乳酸菌发酵得到多肽、寡肽、游离氨基酸和风味物质。在此基础上制成易消化吸收的肉蛋
随着超/特高压电网的发展,大容量电力变压器的应用越来越广泛,变压器所配置保护的动作可靠性至关重要。作为变压器主保护的差动保护,其正确动作率一直受到励磁涌流和电流互感器(CT)饱和等问题的影响。本文着眼于提高变压器差动保护的动作性能,开展了以下几方面的研究工作:对各种工况下变压器差流波形与正弦波形相似程度进行分析,利用变压器故障差流和励磁涌流波形正弦性的差异,提出了两种基于波形相似度的变压器差动保护
在我国,高校心理咨询师在咨询工作的同时,还可能在高校担任教学、行政管理等工作,这也使得我国高校心理咨询多重关系伦理有其特殊议题。本研究采用质性研究的研究方法,对17名
2019年12月16日,民法典草案第三次审议稿第一千一百七十六条对自甘风险规则作出具体规定,(1)由于该规定对于“文体活动”、“一定风险”、“知道”及自愿接受风险的表述过于模糊,容易在司法适用中引发争议,因此需要对这些概念进行解释。而我国对于自甘风险规则的研究主要集中于其存在的必要性与独立性,对于我国审判活动中应如何适用自甘风险规则的研究较少,考虑到近些年来我国司法实践中运用自甘风险规则审理的案件
风电轴承是风电机组的核心零部件,主要包括偏航轴承、变桨轴承、主轴轴承等大型重载轴承。由于轴承套圈滚道表面微观形貌之一的表面粗糙度与轴承性能参数,包括耐磨性、疲劳强度、接触刚度、振动和噪声等密切相关,从而影响整个风电机组的服役寿命和运行可靠性。而超声滚挤压加工技术作为一种新型的塑性成形技术,主要通过高频振动及工具头的滚挤压作用对工件表面进行精密加工,与传统机械加工工艺相比,能够大幅降低被加工表面粗糙
尽管油气储运的方式有很多种方式,但是在多种方式之中,管道运输集平稳、安全和密闭等特点于一身,成为了目前最主要的油气储运方式。然而,由于输油管道分布较广,首末站往往间
J型铺管法是在S型铺管法的基础上发展而来的新型深水铺设技术。管道在下放过程中要承受静水压力、轴力和弯矩的共同作用,极有可能发生局部屈曲,一旦超过了屈曲失效的临界载荷
近年来随着国家建筑业和工业的快速发展,建筑物拆除形成的建筑垃圾以及工业产生的废渣越来越多。在国家相关政策提出绿色环保可持续发展战略后,如何处理这些建筑垃圾和工业废渣成为众多专家学者的研究问题。于是有学者就提出将拆除的废弃混凝土破碎回收再利用,作为再生骨料掺入到混凝土中,不仅绿色环保而且还可以缓解天然骨料的需求。锂渣粉作为生产锂盐的一种工业废料,它也是一种具有一定火山灰活性的矿物掺合料,已有学者把锂
社区作为社会治理的基本细胞,是我们党密切和联系群众的基层重要载体。关注基层党建对社区治理的引领作用的发挥,是夯实我们党在基层密切联系群众、服务群众、发挥基层党组织作用的内在要求,是完善和遵循社区自身发展趋势的客观要求,是夯实我们党的执政基础的必然选择,是坚持党对一切工作领导的根本实践。也是坚决贯彻落实习近平总书记在中国共产党第十九次全国代表大会的报告的指示:“有必要把基层的党组织不断建设成为强大的