瞬时基因表达可溶性的VEGFR2:I-IV及分泌其单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

来源 :华东理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chenxiang1006
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
本文通过RT-PCR的方法从三个月的流产绒毛组织中克隆目的基因VEGFR2 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2,血管内皮细胞生长因子受体2)胞外I-IV区,然后连接到真核表达载体上构建重组表达载体。 首先,在无血清悬浮培养的HEK293细胞中,使用报告基因GFP(Green Fluorescence Protein,绿色荧光蛋白)优化转染条件,发现在转染时DNA:PEI=1:2(w/w)、1.5μg DNA/106cells及开始转染4小时内使用无血清、摇床(120 r/min)时可以达到最佳的转染效率和细胞数量。在确定转染条件之后,将构建的表达载体分别在HEK293细胞、COS-7细胞和CHO-K1细胞中进行瞬时转染表达,结果发现仅在CHO-K1细胞的培养上清中发现目的蛋白表达。瞬时转染CHO-K1细胞至总体积约为1.5 L,由于目的蛋白的羧基端有8-His标签,通过NI2+-IDA.柱纯化得到5mg左右的目的蛋白。 获得纯化蛋白之后,免疫5只Balb/C小鼠,4次免疫之后,检测血清中特异性抗体的表达的情况。选择血清中特异性抗体滴度最强的小鼠,无菌取脾脏。收集脾脏细胞之后计数,然后以5:1的比例与骨髓瘤细胞Sp2/0(HGPRIT)混合,在PEG作用下融合,经过HAT培养基选择性培养10天左右,待细胞长至1/10孔底时,取培养上清作间接ELISA检测,挑选阳性孔,然后将阳性孔进一步亚克隆,筛选到稳定分泌抗VEGFR2的杂交瘤细胞株9株。
其他文献
目的:研究托烷司琼(TPT)的抗心肌肥厚作用。 方法:本实验以环孢菌素A(CsA)为阳性对照,研究TPT对心肌肥厚的作用。腹主动脉缩窄建立压力超负荷性小鼠和大鼠心肌肥厚模型。通
随着社会的发展,我国的医疗基础设施尤为缺乏,因此医院在加快基建项目的建设.通过阐述医院基建项目工程管理的重要性,通过分析基建项目工程管理的具体内容,希望为医院基建项
米诺地尔的稀溶液,作为一种有效治疗脱发的药物,受到了广泛的关注。本文将盐酸胍与氰乙酸乙酯在乙醇钠的作用下缩合,经三氯氧磷氯化、间-氯过氧苯甲酸氧化、与哌啶缩合,以27.9%的
摘 要: 中学美术教育在训练学生智力方面发挥着不可估价的作用,运用得好,有利于学生感受力、观察力、记忆力、想象力、思维力、创造力等的提高。本文主要阐述如何在中学美术教育中提高学生的感受能力、记忆能力、创造能力和想象能力。  关键词: 中学美术教育 学生智力 开发功能  中学美育过程,实际上就是发展和提高各种认知能力、形成完整的智力结构的过程。智力是智慧和能力的综合体现,主要包括感受力、观察力、记忆
课堂是最基本的教学活动场所,它是由教师、学生和环境等元素构成的社会系统。在这个系统中,各元素不断地相互发生作用,难免有时会产生一些矛盾和纠纷,这样就不可能使课堂教学时刻都保持有序和高效。因此,需要对课堂教学进行管理,目的是让课堂教学顺利实施,并取得最佳的效果。课堂教学活动是一个复杂多变的过程,对学生来说它是一个不寻常的认识过程,对教师而言则是一个组织和协调的综合过程,因而它也就是一个管理的过程。正
黄克诚认为,从中央红军开始长征到遵义会议前这一段,有许多教训值得记取。1、中央作出放弃中央根据地的重大决策,比较仓促。事先,不仅没有向苏区群众作必要的交待,就连红军
摘 要: 教学是教师的教与学生的学的统一,是教师与学生相互交往的过程。在整个教学过程中,教师是组织者、引导者,而学生则自由、民主地参与教学活动,思考和解决问题。学生一旦对学习有了兴趣,就会轻松地、自觉地学习,从而取得理想的成绩。本文对如何培养初中科学学习的兴趣进行分析。  关键词: 初中科学教学 学习兴趣 演示实验 直观教学  一、联系生活设置问题,激发兴趣  初中科学研究的中心是“人与自然”,内
后进生在每个学校每个班级都存在,只因为每个学校及班级层次不同而程度不同。新课程改革倡导教学以教师为主导,学生为主体,主张自主、合作、探究的新型学习方式,如果处理得不好,学习基础较差的学生就更容易跟不上进度,久而久之就会掉队。那么在新的课改背景下如何做好后进生的转化工作呢?笔者结合自己多年的教育教学经验,就后进生的转化工作谈谈见解。  一、真心实意地关爱后进生  对于如何做好后进生教育转化工作,一位
饲草作物是指为增加土壤肥力,防止土壤侵蚀,累积和保护土层,增加土壤养分和含水率以及提高土壤质量而种植的植物.饲草作物为农田土壤提供了诸多益处,其还有助于增加和维持土
就学生来说,班主任管理是至关重要的一环,一个好的班主任就是一个好班级;就科任教师来讲,班主任工作直接关系到该班本学科的教学效果,一个好的班主任就是一个好的工作环境;就学生家长而言,班主任工作直接关系到家庭甚至是一个家族的发展,一个好的班主任就意味着孩子的好前景。班主任可谓是这个社会职位最低但责任最大的人,关乎家庭和社会,因此,班主任具备必要的沟通能力显得很重要。  一般来说,一个好的班主任,必须具