目的:脊髓损伤是一种致残率极高的中枢神经系统疾病,系统而全面地了解脊髓损伤过程中病理生理事件,以及相关的细胞机制和分子机制,对于制定新的治疗策略至关重要。因此,我们建立了大鼠T9半横断模型,对大鼠脊髓损伤后环状RNA、长链非编码RNA、信使RNA等进行较高密度时间点的测序分析,筛选出随时序性变化起重要调控作用的环状RNA和长链非编码RNA。然后在星形胶质细胞中进行功能初探,进一步揭示其分子机制。本课题的开展和完成将有助于从新的角度阐明脊髓损伤修复的机制,为临床治疗提供新的分子干预靶点。方法:1、制备大鼠T9半横断模型。为了全面、准确地研究脊髓损伤过程中环状RNA和长链非编码RNA的时序表达,我们选取了T9半横断后0 h、0.5 h、3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d共11个时间点进行取材,存于液氮后送至公司进行全转录组测序(包括信使RNA,环状RNA和长链非编码RNA测序)。2、环状RNA和长链非编码RNA的鉴定。对于测序后的数据进行筛选,采用实时定量PCR对选取的环状RNA和长链非编码RNA进行表达模式的验证。选取了circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675进行进一步的功能探究。3、体外培养脊髓来源的原代星形胶质细胞。采用FISH实验检测circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675的细胞定位。设计circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675的si RNA和对照si RNA,电转染培养至P2代的星形胶质细胞。采用CCK-8法和Ed U法检测干扰circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675对星形胶质细胞增殖的影响;采用划痕实验和Transwell小室实验检测干扰circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675对星形胶质细胞迁移的影响;通过流式细胞仪检测干扰circRNA＿01477和LncRNALOC100909675对星形胶质细胞凋亡的影响。4、干扰circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675后表达谱分析及验证。将circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675敲降后的星形胶质细胞提取RNA后,进行信使RNA芯片分析或测序分析。通过生物信息学分析工具进行聚类分析及蛋白互作网络分析;选取与星形胶质细胞增殖、迁移相关的基因进行实时定量PCR验证。5、体内干扰circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675对胶质瘢痕的影响。合成si RNA或者构建AAV病毒进行脊髓损伤后T9位置原位注射。采用实时定量PCR检测干扰效率,通过免疫组织化学方法检测GFAP、NF200等的表达;采用BBB评分和TSE精细评估系统检测大鼠后肢运动功能。结果1:1、免疫组织化学结果显示成功建立了大鼠T9半横断模型。全转录组测序结果显示,在脊髓损伤后的任何时间点(第0、1、3、7、14、21或28天),360个环状RNA均有差异表达(P<0.05)。在这些环状RNA中,有31个是外显子类型的(占8.61%),33个是基因间的(占9.16%),1个是内含子的(占0.28%),295个是意义重叠的(占81.95%)。94%差异表达的环状RNA水平从第3天开始下降。2、在差异表达的外显子类型中选取了19个环状RNA进行进一步的研究。RNase R处理和经DNA测序鉴定,结果显示环状RNA特征。选取了circRNA＿01477、circRNA＿03612、circRNA＿26782、circRNA＿17645进行q RT-PCR检测。结果显示,所选环状RNA的表达水平在脊髓损伤后显著降低,其模式与RNA-seq结果一致。3、细胞核和细胞质分离实验显示,93.5%的circRNA＿01477分子在胞质中,6.5%的存在于细胞核中。FISH实验结果显示18s r RNA在胞质中表达,而circRNA＿01477在胞质和胞核中都表达。4、采用CCK-8法检测细胞活力,结果显示干扰circRNA＿01477的表达明显降低了星形胶质细胞的活力;Ed U染色结果显示干扰circRNA＿01477的表达明显抑制了星形胶质细胞的增殖。采用Transwell实验和划痕实验来验证敲降circRNA＿01477对星形胶质细胞迁移的影响,结果显示干扰circRNA＿01477的表达显著的抑制了细胞迁移。流式结果显示,敲降circRNA＿01477不会引起星形胶质细胞的凋亡。5、免疫组织化学结果显示,体内降低circRNA＿01477的表达可以减少脊髓中GFAP的表达,减少胶质瘢痕空洞的大小。6、circRNA＿01477 si RNA处理星形胶质细胞后进行表达谱芯片分析,得到差异变化的基因有1528个,其中上调的基因有633个,下调的基因有895个。对差异基因进行GO分析,结果表明,Biological Process板块中富集最多的是趋化性;Cellular Component板块富集最多的是胞外空间;Molecular Function板块富集最多的是细胞因子的活性;基于KEGG通路的顶部富集是细胞因子-细胞因子受体相互作用。7、敲降circRNA＿01477显著降低了IL6R、Ccnd3、Cxcl12、Cxcl14、Gcnt1、Inhbb1、Ntrk2基因的表达水平;抑制circRNA＿01477显著提高了mi RNA-423-5p水平,而mi R-760没有明显变化。在星形胶质细胞中过表达mi RNA-423-5p mimic,q RT-PCR检测Cxcl12、Cxcl14、Gcnt1和Ntrk2的表达,结果显示过表达mi RNA-423-5p,可以明显降低Cxcl12、Cxcl14的表达,而对Gcnt1和Ntrk2的表达没有影响。结果2:1、全转录组测序筛选到1182个差异表达的长链非编码RNA。q RT-PCR验证显示LncRNA LOC100909675在脊髓损伤后各时间点表达逐渐上调,与RNA-seq结果相似。软件分析结果表明LOC100909675不能编码蛋白质,是一个非编码RNA。2、RACE结果显示LOC100909675的全长为1270 bp。细胞核和细胞质分离实验显示,11.2%的LOC100909675分子在胞质中,88.8%的存在于细胞核中。FISH实验结果显示18s r RNA在胞质中表达,而LOC100909675主要在细胞核中表达。3、采用CCK-8法检测细胞活力,结果显示干扰LOC100909675的表达明显降低了星形胶质细胞的活力;Ed U染色结果显示干扰LOC100909675的表达明显抑制了星形胶质细胞的增殖。Transwell实验和划痕实验显示干扰LOC100909675的表达显著抑制了星形胶质细胞的迁移。流式结果显示,敲降LOC100909675不会引起星形胶质细胞的凋亡。4、免疫组织化学结果显示,体内降低LOC100109675的表达可以增加脊髓中NF200的表达,减少胶质瘢痕空洞的大小。5、BBB评分显示,注射AAV9-sh LOC100909675大鼠的后肢运动能力相对于对照组在7 d、10 d和14 d有明显的提高。进一步采用TSE精细运动评估系统评价大鼠的精细运动,结果显示,对照组大鼠髋关节的角度变化率为9.7%,注射AAV9-sh LOC100909675的为16.7%;对照组大鼠膝关节的角度变化率为13.1%,注射AAV9-sh LOC100909675的为18.9%;对照组大鼠踝关节的角度变化率为14.6%,注射AAV9-sh LOC100909675的为30.9%。6、LOC100909675 si RNA处理星形胶质细胞后进行表达谱测序分析,得到差异表达的基因1457个,其中上调表达的705个,下调表达的752个。对差异表达的基因进行GO富集分析,发现富集程度最高的是细胞周期。KEGG富集分析结果显示富集最显著的也是细胞周期。q RT-PCR验证显示,敲降LOC100909675显著降低了与细胞周期相关的基因Anxa1、Anrkb、Brca1、Bub1、Prc1、Kif11、Foxm1、Ect2、Ccna2、Skp2、Cdk1、Cdc20表达,其趋势与测序结果相似。结论:1、成功建立SD大鼠T9半横断模型,筛选到360个差异表达的circRNA和1182个差异表达的LncRNA,提示非编码RNA参与了脊髓损伤的病理生理过程。2、对其中选择的circRNA＿01477的功能和机制的研究表明:该分子主要定位在细胞质中,敲降其表达显著抑制了星形胶质细胞的增殖、迁移和愈伤能力,对凋亡没有影响;体内降低circRNA＿01477的表达可以减少胶质瘢痕空洞的大小。通过GO分析和KEGG分析,circRNA＿01477可能是SCI诱导的免疫炎症反应的重要调控因子,推测其可能通过mi RNA-423-5p-Cxcl12/Cxcl14轴来调控细胞增殖和迁移。3、对其中选择的LncRNA LOC100909675的功能和机制的研究表明:该分子主要定位在细胞核中,敲降其表达显著抑制了星形胶质细胞的增殖、迁移和愈伤能力,对凋亡没有影响;体内降低LOC100909675的表达可以促进SD大鼠后肢功能恢复。根据GO富集分析和KEGG富集分析结果,LOC100909675可能是一个细胞周期调控分子。