随着人民生活水平的不断提高,血管性疾病(包括心血管疾病、脑血管疾病、外周血管疾病等)发病率不断升高,严重影响人类的身体健康,已成为全球性的公共卫生问题,同时也是目前中国成年人的首位死因。以上血管性疾病共同的病理基础是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS),在此基础上出现血管管腔狭窄、斑块形成,从而发生一系列的临床事件。对于血管性疾病的基础与临床研究是目前医学领域的热点问题。研究动脉粥样硬化发生与发展的病理生理机制,有助于寻找临床治疗治疗动脉粥样硬化性疾病的有效靶点,从而改善患者的长期预后。同时,在血管性疾病的治疗方面,经皮血管成形术得到了越来越广泛的应用,但其术后再狭窄的发生影响了患者的长期治疗效果。因此,有必要对AS以及再狭窄进行深入研究。目前研究证实,动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病。在动脉粥样硬化发生发展的各阶段中,均有不同程度的炎症反应发生。研究已经证明白细胞介素-8(Interleukin-8, IL-8)等趋化因子及其特异性受体在动脉粥样硬化中起重要作用。IL-8主要通过损伤血管内皮,导致内皮细胞功能紊乱,从而失去抗黏附和抗聚集的作用,促使血液中单核细胞聚集到内膜上及向内膜下转移。单核细胞与血管内皮细胞互相黏附可进一步促进IL-8、MCP-1、TNF-α、IL-β、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等细胞因子的表达,进而激活单核-巨噬细胞、平滑肌细胞,迁移至局部粥样斑块中形成泡沫细胞。而对于PCI术后再狭窄机制的研究表明,血管内皮细胞过度增生及血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖、迁移是发生再狭窄的主要原因,而炎性反应在这一过程中起重要作用。观察血管损伤后炎性因子的变化规律以及与平滑肌细胞增殖的关系,有助于理解粥样硬化发生与进展的进程,有助于阐明血管成形术后再狭窄等主要并发症的病理生理学机制,从而提高血管成形术的临床治疗效果。本研究通过球囊扩张拉伤兔腹主动脉,建立动脉粥样硬化模型,造影检查腹主动脉管腔狭窄变化情况,采用组织病理观察血管球囊扩张术后内膜和中层平滑肌的结构改变,观察血管损伤后不同时间点炎性因子IL-8、CRP、IL-6、TNF-α变化规律,分析IL-8与CRP、IL-6、TNF-α之间的关系,明确IL-8水平变化对于血管狭窄程度、内膜与血管中层结构的影响。利用免疫组化、RT-PCR等技术,观察血管平滑肌细胞IL-8 mRNA及蛋白表达对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响,为治疗动脉粥样硬化和防治PCI术后再狭窄提供可靠的理论依据。本研究分为四部分:一、兔腹主动脉动脉粥样硬化模型的建立方法:选取8-12月龄新西兰大白兔24只,雌雄不拘,实验前适应性饲养7d,均单笼饲养,摄水、摄食不限。实验后继续喂养,至动脉粥样硬化模型建立成功。将实验动物随机分为二组:(1)实验组(experiment group,n=12),(2)对照组(control group,n=12)。以10g/L戊巴比妥钠3.0-3.5ml/kg耳缘静脉注射麻醉实验动物,常规消毒铺巾后,seldinger技术穿刺股动脉并留置鞘管,经鞘管注入普通肝素200单位抗凝,沿导引钢丝逆行插入球囊,造影后将球囊定位,置于髂动脉以上2个椎体处,以405.30~607.95 kPa压力扩张球囊,同时注射造影剂证实球囊完全扩张堵闭腹主动脉,自近心端缓慢回拉(拉伤长度4cm),反复3次,每次扩张时间20秒,间隔15秒,造成球囊扩张拉伤兔腹主动脉。对照组动物术前准备以及麻醉方法同实验组,仅穿刺留鞘,不进行球囊拉伤。4周后处死动物前复查造影,进行病理检查观察组织学变化。结果:4周后造影检查,发现腹主动脉拉伤处出现明显狭窄,而对照组动物无明显变化。病理检查结果:肉眼观察对照组动物动脉柔软、有弹性,颜色粉红均匀,管腔内膜较光滑。实验组动物腹主动脉拉伤处出现典型的动脉粥样硬化特征:外观颜色发白或黄白相间,粗细不均匀,管壁明显僵硬。取材后见管壁增厚,内膜可见白色条纹或大小不等黄白色斑块隆起。光镜下形态学观察:对照组兔腹主动脉血管壁内膜、中膜、外膜三层结构明显,内膜完整、无增厚,内皮下无脂质沉积,中膜平滑肌细胞细长呈梭形,细胞核蓝染,同心圆状排列整齐;实验组兔腹主动脉管腔狭窄,内膜明显增厚,内皮下可见泡沫细胞聚集,中膜平滑肌细胞排列紊乱,单位面积细胞核数量增多。二、经皮腹主动脉球囊扩张成形后炎性因子的变化方法:选取8-12月龄新西兰大白兔24只,雌雄不拘,体重2.50-3.25kg,由河北医科大学实验动物中心提供。以上随机分为实验组和对照组,每组各12只动物。实验组通过股动脉穿刺,留置鞘管后送入球囊,对兔腹主动脉进行球囊扩张拉伤腹主动脉。对照组只进行股动脉穿刺留鞘,不进行球囊拉伤。分别于实验前,实验后4小时、1天、3天、1周、2周、4周,耳缘静脉采血4ml,3000r/min离心20min后,取上清液得血清标本,-80℃冰箱统一保存。通过酶联免疫双抗体夹心法测定兔腹主动脉球囊扩张后各时间点IL-8、IL-6、TNF-α和CRP水平变化情况,探讨兔腹主动脉球囊扩张后炎性因子水平变化的规律,阐明其作用机制以及与动脉粥样硬化之间的关系。结果:两组动物月龄、性别、术前后体重、术前后血脂水平等一般情况相比,差异无显著性意义(p>0.05),具有可比性。两组动物实验前后炎性因子水平变化情况:实验组动物球囊损伤4小时后IL-8水平即开始升高,术后1天达到峰值。IL-6、TNF-α、CRP水平24小时开始升高,术后3天达到峰值,上述炎性因子持续增高4周,均明显高于对照组(p<0.01);相关性分析:IL-8水平与IL-6、TNF-α、CRP水平呈正相关,相关系数r分别为0.769,0.673,0.897(p均<0.05)。三、白介素-8和腹主动脉粥样硬化狭窄的关系方法:选择新西兰大白兔36只为实验对象,雌雄不拘,体重2.50-3.25kg,由河北医科大学实验动物中心提供。以上实验动物随机分为实验组(experiment group)、IL-8单克隆抗体治疗组(治疗组,treatment group)和对照组(control group),每组各12只动物。实验组和治疗组动物通过穿刺股动脉,送入球囊拉伤腹主动脉。治疗组动物通过耳缘静脉注射IL-8单克隆抗体进行干预。对照组动物只进行股动脉穿刺和留置鞘管,不进行球囊扩张拉伤。分别于实验前,实验后4小时、1天、3天,1周、2周、4周,耳缘静脉采血4ml,检测三组动物血清IL-8水平,4周后处死动物进行病理组织学检查,应用光学显微镜和计算机病理图象分析系统分析测定以下指标:内膜中膜厚度、面积,计算血管狭窄程度[(邻近正常血管管径-狭窄段最小管径)/邻近正常血管管径]。结果:实验组动物球囊损伤4小时后IL-8水平即开始升高,术后1d达到峰值,持续增高4周,且明显高于治疗组和对照组。治疗组和对照组动物IL-8水平无上述变化规律。实验组动物腹主动脉明显狭窄,组织学检查内膜面积和中膜面积、血管狭窄程度等指标大于治疗组和对照组(p <0.01),治疗组管腔有所狭窄,对照组动物管腔无明显变化,治疗组与对照组无显著性差异(p>0.05)。相关分析显示,IL-8水平与内膜厚度、内膜面积、中膜厚度、中膜面积、斑块积分等呈正相关(相关系数r分别为0.815,0.894,0.783,0.801,0.912,p均<0.01)。多元回归分析显示IL-8水平是腹主动脉发生狭窄的独立危险因素(p <0.01)。四、白介素-8mRNA和蛋白表达对兔腹主动脉平滑肌细胞增殖的影响方法:选择新西兰大白兔36只为实验对象,雌雄不拘,体重2.50-3.25kg,由河北医科大学实验动物中心提供。以上实验动物随机分为实验组(experiment group)、IL-8单克隆抗体治疗组(治疗组,treatment group)和对照组(control group),每组各12只动物。利用免疫组化染色、RT-PCR技术观察动脉粥样硬化斑块中IL-8mRNA以及蛋白表达情况,增殖细胞核抗原PCNA染色分析后,用光学显微镜和计算机病理图象分析系统测定每40倍视野中PCNA阳性细胞比例,计算阳性细胞数和阳性细胞百分率。结果:三组之间一般情况比较,差异无统计学意义。实验组IL-8mRNA表达明显高于治疗组和对照组,差异具有统计学意义(p<0.05),治疗组高于对照组,无统计学意义。免疫组化显示,实验组与治疗组和对照组比较,IL-8蛋白阳性表达明显升高(p<0.05),治疗组高于对照组,无明显差异。PCNA阳性细胞比例比较,实验组明显高于治疗组与对照组(p<0.05),治疗组明显高于对照组(p<0.05)。相关分析显示IL-8阳性表达细胞数与PCNA阳性细胞数呈正相关,相关系数r=0.864(p<0.01)。结论:1.通过介入方法进行球囊拉伤可成功建立兔腹主动脉粥样硬化动物模型;2.兔腹主动脉球囊扩张拉伤后,引起IL-8、IL-6、TNF、CRP等水平升高,其中IL-8最先升高,达峰时间短,可能在炎性反应激活的过程中起到了关键的调节作用;3. IL-8水平高表达引起腹主动脉动脉粥样硬化狭窄的产生,经IL-8单克隆抗体治疗后动脉狭窄程度明显减轻。IL-8水平与动脉狭窄程度呈正相关,IL-8是发生腹主动脉粥样硬化狭窄的独立危险因素;4.球囊损伤引起腹主动脉局部IL-8mRNA和蛋白表达增高,并导致平滑肌细胞增殖。白介素-8单克隆抗体治疗后,IL-8mRNA及蛋白水平下降,并抑制平滑肌细胞的增殖。