重楼皂苷D诱导HL-60细胞向单核系的分化及其机制

来源 :大连医科大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:henrychan168
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目的:重楼为百合科植物,是多年生的草本植物,广泛存在于亚洲,特别是我国云南。重楼的干燥根茎可供药用,具有镇静、清热解毒、消炎抗菌、抗肿瘤等作用。目前已从重楼中分离得到的有重楼皂甙I、重楼皂甙II、重楼皂苷D等多种有生物活性的单体成份,其抑制肿瘤的作用已经引起研究者们极大的关注。急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是一种较常见、临床表现凶险的急性白血病,多见于青壮年,90%的患者有弥散性血管内凝血导致的出血。临床多采用诱导白血病细胞分化的药物进行治疗。本实验拟选取急性早幼粒白血病细胞HL-60为研究对象,选取重楼小分子提取物重楼皂苷D(Polyphyllin D,PD),以探讨重楼皂苷D是否诱导HL-60细胞株的分化及其可能的分子机制。方法:1.本实验选用HL-60白血病细胞株为研究对象。2.本实验的分组:(1)对照组(Control):HL-60细胞经终浓度为0.05%DMSO作用;(2)实验组:0.05μMPD组:HL-60细胞经终浓度为0.05μM重楼皂苷作用72h;0.1μM PD组:HL-60细胞经终浓度为0.1μM重楼皂苷作用72h;0.2μM PD组:HL-60细胞经终浓度为0.2μM重楼皂苷作用72h。(3)抑制剂组:1)P38的抑制剂组: SB203580组:HL-60细胞经10μmol/l P38的抑制剂SB203580作用30min; SB203580+PD组:HL-60细胞经10μmol/l P38的抑制剂SB203580预处理30min后再由重楼皂苷0.1μM处理72h;2)ERK1/2的抑制剂组: U0126组:HL-60细胞经20μmol/lERK1/2的抑制剂U0126处理30min; U0126+PD组:HL-60细胞经20μmol/lERK1/2的抑制剂U0126预处理30min后由经0.1μM重楼皂苷处理72h。3.采用MTT法检测不同浓度下的(0、0.025、0.05、0.025、0.05、0.4、0.8、1μM)重楼皂苷在不同作用时间(24h、48h、72h)对HL-60细胞增殖速度的影响。4.通过流式细胞仪检测各组HL-60细胞单核系表面分子抗原CD14表达情况。5.Wright-Giemsa染液染色后,显微镜下观察重楼皂苷作用于HL-60细胞后的形态。6.应用Western blot方法检测药物作用HL-60细胞后蛋白的变化:包括P-ERK1/2、ERK1/2、P-P38、P38。结果:1.MTT结果显示,重楼皂苷能够明显地抑制HL-60细胞生长速度,并明显表现出剂量和时间依赖。2.瑞氏吉姆萨染色的结果显示,与对照组细胞处理的细胞比较,重楼皂苷作用后部分细胞核一侧扁平或凹陷,胞浆染色变浅。3.流式细胞术检测结果显示,随着重楼皂苷浓度的升高(0、0.05、0.1、0.2μM),CD14明显增加,其CD14由2.93%分别增加到8.22%、23.33%、42.65%;U0126+PD组的CD14结果为11.3%;而SB203580和SB203580+PD组的CD14的结果分别为6.96%、33.8%。4.Western blot结果显示,重楼皂苷能够上调HL-60细胞P-ERK1/2的表达,下调P-P38的表达;P38抑制剂SB203580作用细胞后,P-ERK1/2表达水平上升。结论:重楼皂苷诱导HL-60细胞向单核系分化的机制可能是ERK1/2的激活,同时伴随有P38表达受到抑制。本实验为进一步了解重楼皂苷诱导分化治疗的机理提供帮助,也为今后重楼皂苷安全地、有效地治疗急性早幼粒白血病提供了重要依据。
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