【摘 要】
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目的:乳腺癌和卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤,其发病机制与多种肿瘤抑制基因和癌基因的突变及异常密切相关。抑癌基因OVCA1（ovarian cancer gene1）是1996年发现的与乳腺癌和卵巢癌密切相关的基因。本课题前期研究发现泛素-蛋白酶体途径是野生体OVCA1蛋白降解机制之一。并有研究发现在乳腺癌中OVCA1基因Ala34点突变为Asp34,Ser389点突变为Arg389。为初步揭示OVC
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目的:乳腺癌和卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤,其发病机制与多种肿瘤抑制基因和癌基因的突变及异常密切相关。抑癌基因OVCA1（ovarian cancer gene1）是1996年发现的与乳腺癌和卵巢癌密切相关的基因。本课题前期研究发现泛素-蛋白酶体途径是野生体OVCA1蛋白降解机制之一。并有研究发现在乳腺癌中OVCA1基因Ala34点突变为Asp34,Ser389点突变为Arg389。为初步揭示OVCA1突变体34M、389M的降解途径以及与肿瘤的关系提供实验依据,本文对野生体OVCA1 34和389位点进行点突变,并探索MG132对其蛋白表达的影响。方法:1.以本实验室制备并保存的OVCA1真核表达重组质粒为基础,采用重组PCR技术构建OVCA1 34和389位点突变体（OVCA1-34M和OVCA1-389M）真核表达质粒,酶切/PCR初步鉴定后,进行序列测定。2.采用MTT法确定不影响乳腺癌细胞MCF-7活性的最大MG132浓度。3.采用脂质体法将OVCA1野生体和突变体（OVCA1-34M和OVCA1-389M）真核表达质粒分别转染入HEK293和MCF-7细胞,以未转染细胞及转染空载体细胞为对照组。转染24h后加入MG132作用24h,以MG132未处理组为对照。荧光拍照后,Western blot方法检测外源野生体和突变体OVCA1蛋白的表达情况。结果:1.测序证实获得了OVCA1第34和389突变体。2.MG132浓度为0μM、5μM、10μM、15μM时,对MCF-7细胞活性不产生显著影响（p＞0.05）;而当MG132浓度为20μM、40μM、60μM、80μM及100μM时,对MCF-7细胞活性产生显著影响（p＜0.05）。因此,不影响MCF-7细胞活性的最大MG132浓度为15μM。3.在HEK293细胞中,分别对于OVCA1突变体34M、389M,未经MG132处理组的蛋白相对表达量为0.066±0.013、0.576±0.028;MG132处理组的蛋白相对表达量为1.006±0.064、1.170±0.132。MG132处理组的OVCA1蛋白的相对表达量明显高于未经MG132处理组（p＜0.05）。在MCF-7细胞中,分别对于OVCA1突变体34M、389M,未经MG132处理组的蛋白相对表达量为0.044±0.008、0.357±0.043;MG132处理组的蛋白相对表达量为0.712±0.029、0.732±0.041。MG132处理组的OVCA1蛋白的相对表达量明显高于未经MG132处理组（p＜0.05）。结论:1.成功构建OVCA1 34和389位点突变体。2.MG132抑制OVCA1突变体34M、389M蛋白的降解。说明泛素-蛋白酶体系统可能参与OVCA1突变体34M、389M蛋白的降解。
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