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趋化因子是细胞因子的一个大的家族,是先天性免疫系统的重要组成部分,它们能够刺激受感染或者损伤部位淋巴细胞的补充、激活和黏附。趋化因子是8-15kD的蛋白。绝大多数趋化因子含有4个保守的半胱氨酸残基(Cys),根据此4个保守半胱氨酸残基的排列形式不同,趋化因子基因可以分为4个基因亚族:CXC(α)、CC(β)、C(γ)和CX3C(δ)。CXC和CC类趋化因子是趋化因子大家族中最大的两个亚族。本课题组构建了经济海水养殖鱼类大菱鲆脾脏和头肾cDNA文库,从文库中筛选出了5种趋化因子,其中两种是CXC趋化因子,编号为S457和S950,另外三种是CC趋化因子,编号为K1063、SC70和KC70。根据从文库中得到的大菱鲆趋化因子部分cDNA序列,利用5’和3’RACE的方法,克隆到了这5个序列未知的5’和3’序列,得到了它们的全长cDNA。根据这5种趋化因子的开放阅读框架设计了特异引物,通过PCR的方法扩增得到了它们的基因序列。除了SC70,其他4种趋化因子基因都含有4个外显子和3个内含子,而SC70仅含有3个外显子和2个内含子。它们的氨基酸序列都含有4个保守的半胱氨酸残基。经过BlastP保守结构域搜索和SignalP的信号肽分析,确定了这5种趋化因子的保守结构域和信号肽序列。首先构建了鱼类CXC趋化因子和其他已知CXC趋化因子的系统发生树,建立了4个包含有鱼类CXC趋化因子的直向进化同源组,确定了S950是一种CXCL10样的趋化因子,而S457仅和CXCL9、CXCL10、CXCL11相近。同时,也构建了鱼类CC趋化因子和其他已知CC趋化因子的系统发生树,建立了5个同时含有鱼类和其他物种CC趋化因子的直向进化同源组和一个全部为鱼类CC趋化因子的直向进化同源组,结果发现SC70和人的CCL25相类似,而KC70和人的CCL19相类似,但是K1063无法确定其分类。利用RT-PCR的方法对大菱鲆的这5种趋化因子在体内、胚胎发育过程、胚胎细胞系以及感染个体中的表达做了半定量分析。结果如下:(1)在大菱鲆正常组织中,S457在免疫系统中表达强烈,尤其是在脾脏和肾中,但是在头肾中表达很微弱,而S950检测不到表达。K1063在肝脏、脾脏、头肾和肾中有强烈的表达,KC70只有在两个组织(脑、皮肤)内没有检测到表达,而SC70则在每个组织内都有表达。(2)在大菱鲆不同胚胎发育时期,S457从体节期才检测到它的微弱表达,而且到仔鱼期它的表达水平一直保持微弱表达,未有明显变化。整个胚胎发育时期都检测不到S950的表达。3种CC趋化因子也呈现了不同的表达趋势。K1063在任何时期内都没有发现表达迹象。当胚胎发育至出膜前期,SC70开始有了微弱表达,在仔鱼期它的表达非常强烈。比起SC70,KC70在胚胎发育时期开始表达的时间更早,从原肠期开始就有比较高水平的表达。(3)在鳗弧菌感染的TEC细胞内,只有S457在感染6h后检测到了强烈表达,持续到12h后,表达减弱。其他4中趋化因子均没有检测到表达迹象。(4)在鳗弧菌感染的大菱鲆体内三种组织(肝、脾脏和头肾)中,S457和S950在感染后均有表达升高趋势,然后随着感染时间延长表达水平逐渐变弱。K1063和SC70对鳗弧菌感染能够很快产生应答,表达水平呈现升高然后降低的趋势,而KC70的表达水平不受感染影响。