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隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是隐孢子虫(Cryptosporidium)寄生于人类和动物呼吸道或消化道上皮细胞刷状缘纳虫空泡中,以腹泻、脱水为主要临床症状的寄生性原虫病。隐孢子虫可感染多种动物,其中幼龄动物最易感,是新生动物腹泻的病因之一。隐孢子虫病已严重危害人类和动物健康,给畜牧业带来严重的经济损失,目前无有效的治疗药物,疫苗免疫是防控该病的新策略,因此,筛选免疫原性高的靶抗原具有相当重要的意义。目前保定地区对微小隐孢子虫相关研究较少,对重组蛋白CP23免疫特性进行研究,为抗微小隐孢子虫疫苗和免疫学诊断方法的研制提供了候选抗原,为隐孢子虫病的防控奠定了基础。本试验从河北保定地区分离得到奶牛源隐孢子虫卵囊,通过PCR扩增获得18SrRNA全基因1188bp的片段,构建pEASY-18SrRNA质粒并测序,对测序序列应用DNAStar软件进行分析,结果表明分离到的虫种为微小隐孢子虫。将Cp23基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET28a-Cp23。并用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE结果显示,表达蛋白分子量为25kDa,且为包涵体蛋白。Western blotting结果表明,表达产物可被微小隐孢子虫阳性血清识别,具有良好的免疫反应原性。本试验将纯化的重组蛋白CP23免疫4周龄BALB/c小鼠,进行细胞免疫和体液免疫应答的检测。以建立的间接ELISA方法检测特异性IgG抗体,结果显示,试验组IgG水平随着免疫次数的增加也呈现明显上升趋势,并且特异性抗体效价可达到1:12800;试验组的CD4+/CD8+T淋巴细胞数值与对照组相比均增加明显,其中CD4+T淋巴细胞数值更高;IL-12、IL-4、IL-10及IFN-γ浓度亦都增高,与对照组相比均有统计学意义(P<0.01)。由以上体液免疫和细胞免疫分析结果显示,河北保定地区微小隐孢子虫重组蛋白CP23免疫小鼠后诱导机体产生了Th1/Th2型混合免疫反应,能有效诱导机体产生特异性免疫应答,增强机体免疫功能,具有良好的免疫特性。将重组质粒pEASY-18SrRNA进行10倍梯度稀释,选用其中6个连续梯度的质粒,建立微小隐孢子虫荧光定量PCR标准曲线。对荧光定量PCR方法的条件进行优化,对荧光定量PCR方法的敏感性、特异性、重复性进行分析,对保定地区30份样品使用普通PCR与荧光定量PCR进行检测。结果显示,质粒模板拷贝数在3.5×10~6～3.5×10~1,均能扩增出曲线;敏感性可达到标准DNA质粒的35个拷贝数,特异性分析显示仅有微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫DNA出现扩增曲线,重复性分析显示变异系数均小于3%;临床样品检测结果为阳性率30%(9/30),并可检测到78个拷贝数。建立的荧光定光PCR方法,可满足临床检测隐孢子虫的需要,为流行病学调查提供快速灵敏的检测方法。