论文部分内容阅读
目的:1.通过研究黄柏碱对α-葡萄糖苷酶的体外抑制作用、作用方式以及作用分子机制,探讨降糖中药黄柏中主要成分之一黄柏碱通过抑制α-葡萄糖苷酶活性降低餐后血糖的可能性。2.通过建立胰岛素抵抗(IR)HepG2细胞模型,研究黄柏碱对IR-HepG2细胞糖脂代谢紊乱状态的改善作用,并通过考察其对IR-HepG2细胞IRS-1/PI3K/Akt胰岛素信号通路的干预作用来探讨黄柏碱改善HepG2细胞胰岛素抵抗状态可能的作用机制,为后续探讨黄柏碱的体内降糖作用提供实验基础。方法:1.建立α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选模型,以对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物,阿卡波糖为阳性对照,研究黄柏碱对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率,采用动力学方法研究黄柏碱的酶抑制作用类型,并采用同源建模的方法构建α-葡萄糖苷酶的三维结构,运用分子对接技术分析黄柏碱抑制α-葡萄糖苷酶的潜在分子作用机制。2.MTT 法检测不同剂量黄柏碱(6.25、12.5、25、50、100、200、400 μ M)给药48 h对HepG2细胞的细胞毒性。3.采用1 mM棕榈酸联合2 mM油酸诱导IR-HepG2细胞模型,用葡萄糖氧化酶法检测不同剂量黄柏碱(6.25、12.5、25、50、100 μ M)分别处理IR-HepG2细胞12、24和48 h后对培养液中葡萄糖的消耗量。4.MTT 法检测不同剂量小檗碱(6.25、12.5、25、50、100、200、400 μ M)给药24 h对HepG2细胞的细胞毒性。5.采用葡萄糖氧化酶法检测不同剂量小檗碱(6.25、12.5、25、50、100 μ M)处理IR-HepG2细胞24 h后对培养液中葡萄糖的消耗量。6.采用甘油三酯(TG)、胆固醇(TCH)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测试剂盒分别测定黄柏碱低、中、高剂量组(25、50、100 μ M)处理IR-HepG2细胞24 h后TG、TCH、LDL-C和HDL-C的含量,并设置小檗碱组做对比。7.采用RT-qPCR法检测黄柏碱低、中、高剂量组(25、50、100 μM)处理IR-HepG2细胞 24 h 后 IRS-1/PI3K/Akt 胰岛素信号通路 INSR、IRS-1、PI3K、Akt2 和 GSK-3 β因子的mRNA表达,并设置小檗碱组做对比。8.采用Westen-Blot法检测黄柏碱低、中、高剂量组(25、50、100 μ M)处理IR-HepG2细胞24 h后IRS-1/PI3K/Akt胰岛素信号通路关键蛋白p-IRS-1(Ser307)、p-Akt(Ser473)和p-GSK-3 β(Ser9)的磷酸化水平以及PI3K蛋白的表达水平,并设置小檗碱组做对比。结果:1.黄柏碱对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)为126.36 mg·L-1,且抑制率随浓度增加而增加。酶动力学结果显示,黄柏碱浓度增大,反应速率降低,Vmax、Km变小。分子对接结果显示,黄柏碱与α-葡萄糖苷酶位点5的结合能最低且其最好的对接构象结合能为-7.5 kcal·mol-1。黄柏碱可能通过与α-葡萄糖苷酶分子中的LYS15、SER295、HIS258等氨基酸残基形成氢键,与残基ALA289形成疏水相互作用以及与残基GLU10形成π-阴离子相互作用发挥其抑制活性。2.黄柏碱给药剂量为6.25至100 μM时,预处理48 h对HepG2细胞无明显毒性作用(P>0.05)。3.不同剂量黄柏碱分别处理IR-HepG2细胞12 h和24 h后,与模型组相比,细胞对葡萄糖的消耗呈现不同程度的升高并呈剂量依赖性,其中以25、50和100 μM这三个剂量组改善作用最强(P<0.05或P<0.01或P<0.001);黄柏碱处理48 h后,与正常组相比,模型组糖耗量无明显变化(P>0.05),给药处理后,有些剂量组的糖耗量与模型组相比虽有稍许提升,但无显著性差异(P>0.05)。因此,综合模型构建效果以及药物作用效果考虑,选择25、50和100 μM为黄柏碱低、中、高给药剂量,24 h为处理时间。小檗碱的处理时间也定为24 h。4.小檗碱给药剂量为6.25至100 μ M时,预处理24 h对HepG2细胞无明显毒性作用(P>0.05)。5.不同剂量小檗碱处理IR-HepG2细胞后,与模型组相比,细胞葡萄糖消耗量均明显升高(P<0.05或P<0.001),综合小檗碱对HepG2细胞的毒性和促进细胞葡萄糖消耗作用考虑,选择6.25、12.5和25 μM为给药剂量。6.1 mM棕榈酸联合2 mM油酸诱导HepG2细胞24 h后,HepG2细胞内TG、TCH和LDL-C含量明显增多(P<0.01),HDL-C含量明显减少(P<0.01),黄柏碱高、中、低剂量组给药后均能显著降低IR-HepG2细胞内TG、TCH和LDL-C含量(P<0.05或P<0.01或P<0.001),黄柏碱高、中剂量组能显著升高HDL-C含量(P<0.05或P<0.001),其中以黄柏碱高剂量(100 μM)或中剂量(50 μM)组的作用效果更明显,略优于小檗碱。7.1 mM棕榈酸联合2 mM油酸刺激下HepG2细胞IRS-1/PI3K/Akt信号通路中关键因子INSR、IRS-1、PI3K、Akt2和GSK-3 β的mRNA表达均显著下调(P<0.05或P<0.01),黄柏碱给药后能上调IRS-1/PI3K/Akt胰岛素信号通路关键因子INSR、IRS-1、PI3K、Akt2和GSK-3 β mRNA的表达,其中以黄柏碱高剂量(100 μM)或中剂量(50 μ M)组的作用效果较为显著(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。8.1 mM棕榈酸联合2 mM油酸刺激能显著增高HepG2细胞p-IRS-1(Ser307)蛋白的磷酸化水平(P<0.01),同时降低PI3K-p85蛋白的表达(P<0.05)和p-Akt(Ser473)和p-GSK-3 β(Ser9)蛋白的磷酸化水平(P<0.05)。黄柏碱给药后能下调 p-IRS-1(Ser307)蛋白的磷酸化水平,上调 p-Akt(Ser473)、p-GSK-3 β(Ser9)蛋白的磷酸化水平和PI3K-p85蛋白的表达水平,其中以黄柏碱高剂量组(100 μM)的作用效果较为显著(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。结论:黄柏碱对α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用,其抑制类型为可逆性的反竞争性抑制。黄柏碱的抑制作用可能主要是通过其与α-葡萄糖苷酶形成氢键、疏水作用和π-阴离子相互作用等实现的。黄柏碱对IR-HepG2细胞糖脂代谢紊乱具有改善作用,其作用机制可能与其调节IRS-1/PI3K/Akt信号通路关键因子INSR、IRS-1、PI3K、Akt2、GSK-3 β mRNA 的表达和 p-IRS-1(Ser307)、p-Akt(Ser473)、p-GSK-3 β(Ser9)蛋白的磷酸化水平以及PI3K-p85蛋白的表达水平相关。