论文部分内容阅读
为了研究早期牛胚胎体母性基因调控期、合子基因调控期基因表达变化的模式,研究牛早期胚胎发育中关键基因的作用,本研究使用单个胚胎mRNA差异法,筛选牛体外受精8细胞期和囊胚期胚胎中表达不同的基因。构建筛选出基因的过表达及干扰载体；用脂质体和电穿孔法将构建好的两种载体分别转入牛胎儿成纤维细胞中,筛选稳定表达细胞株,建立起差异基因的过表达和低表达的细胞系,既可为研究差异基因对细胞生长发育的影响提供细胞模型,也可以作为通过体细胞克隆技术生产转基因胚胎的核供体,进一步研究体外牛胚胎发育过程中相关差异表达基因的作用。1.牛胚胎8细胞期、囊胚期胚胎差异表达基因的筛选通过体外受精获得牛8细胞期和囊胚胚胎早期胚胎,采用单个胚胎mRNA差异显示技术,筛选胚胎发育两个时期表达模式不同的基因,共得到6条基因片段。将6条片段克隆后测序,在GenBank中寻找同源序列,其中2个与已知的功能基因序列有较高的同源性,分别为LYAR、RPL31基因；剩余4条未找到同源序列。采用反转录PCR法鉴定所筛选到LYAR、RPL31基因在早期胚胎中的表达。结果显示LYAR、RPL31的mRNA在两个时期都有表达。而后利用实时定量PCR方法对2个基因在牛8细胞期和囊胚期胚胎中的mRNA相对表达量进行了检测,发现LYAR,RPL31在牛8细胞期胚胎中mRNA的相对表达量分别是囊胚的46倍和3.2倍。2.构建过表达载体pIRES2-EGFP-LYAR/RPL31和干扰载体pGCsi-LYAR/RPL31(1)通过反转录PCR法从牛8细胞胚胎总RNA中扩增编码区cDNA序列,进而克隆LYAR/RPL31基因的CDS编码序列。以双顺反子载体pIRES2-EGFP为骨架,将LYAR/RPL31基因定向连接在Sall+BglⅡ位点,构建LYAR/RPL31两个基因的过表达载体。测序结果表明克隆基因序列正确；限制性内切酶分析表明基因连入方向正确,本研究中所构建的pIRES2-EGFP-LYAR/RPL31过表达载体序列与结构均符合预期设计。(2)分别针对牛LYAR/RPL31基因的5’-CAGAGGCCAAGAAGAATAAGA-3’/5’-CACAAGCGCATCCATGGAGTG-3’设计发卡干扰片段,并将其连接在骨架载体pGCsi-DsRed上,构建pGCsi-LYAR/RPL31干扰载体。3.牛胎儿成纤维上的外源基因转染以及转基因细胞的筛选和鉴定组织块贴壁法分离40-50天胎龄的牛胎儿成纤维细胞,放入37℃、5%C02、饱和湿度培养箱中,采用DMEM/F12+10%FBS培养液继续培养和传代；DMEM/F12+10%DMSO+20%FBS冷冻保护液中冷冻保存各代成纤维细胞。细胞生长活力分析选用第5、第10代细胞的生长曲线；染色体数目分析选用第5代细胞中期染色体图,同时进行了G418对牛胎儿成纤维细胞对毒性实验。结果显示,原代培养后传代2-3次获得了较纯的胎儿成纤维细胞；牛胎儿成纤维细胞的生长速度随代次增加逐渐放缓；第5代染色体数目正常(2n=60)。最终确定选用第3代的胎儿成纤维细胞进行后续外源基因的转导,确定8001μg/ml G418为最佳抗性筛选浓度。分别采用脂质体法和电穿孔法转染牛胎儿成纤维细胞。转染48小时后,利用real-time quantitative PCR技术相对定量检测载体的转染效果。与空载体转染对照组相比, pIRES2-EGFP-LYAR/RPL31过表达载体转染的细胞中LYAR/RPL31的mRNA表达量显著升高(分别是对照组的31.23/45.99倍,P<0.05),pGCsi-LYAR/RPL31干扰载体转染的细胞中LYAR/RPL31mRNA表达量则明显降低,差异显著(分别是对照组的0.047/0.068倍,P<0.05),证明构建的过表达载体和干扰载体具预期的功能,转染后的细胞可用于筛选建立转基因细胞系。转染48小时后加入含有800μg/ml筛选浓度的G418的培养液,放入培养箱37℃、5%CO2饱和湿度条件下高压筛选,获得的抗性克隆细胞经继续扩大培养,分别建立了稳定表达的转基因细胞系,作为差异基因对细胞生长发育的影响的细胞模型。可以为通过体细胞克隆技术生产转基因动物提供核供体,制做转基因胚胎模型,为进一步研究LYAR/RPL31在体外牛胚胎发育过程中的作用奠定了基础。4.牛胚胎差异表达基因功能的研究绘制转基因细胞的生长曲线,结果显示过表达细胞系生长状态与普通成纤维细胞无明显差异；但LYAR/RPL31低表达后造成细胞活力明显降低,生长缓慢。转基因细胞细胞周期检测结果表明,LYAR低表达转基因细胞中G2/M期细胞比例显著增加,RPL31低表达细胞中略有增加。为了确定合适的重构胚激活与发育培养系统,首先进行了孤雌胚的激活与体外发育培养实验。将成熟后排出第一极体的牛卵母细胞置于含有7%乙醇的SOF+BSA发育液中激活7mmin,随后放入含2mM6-DMAP的SOF+BSA发育液中培养4hr,然后移入40μ1SOF+BSA的发育液小滴中培养48hr,卵裂率为74.9%；发育培养7-9天,囊胚率为24.9%。结果说明,在该培养系统下牛孤雌胚胎发育率正常,该系统适合牛核移植重构胚的激活与体外发育培养。核移植重构胚采用上述方案进行激活和体外发育培养。克隆胚胎经发育培养,于激活后第八天统计发育率和囊胚细胞数。体细胞克隆胚、pIRES2-EGFP-LYAR/RPL31克隆胚及pGCsi--LYAR/RPL31克隆胚囊胚发育率分别为27.9%、26.1%/25.0%和10.3%/11.7%；各组囊胚细胞数分别为93、97/92、65/73。结果表明,体细胞克隆胚胎对照组与pIRES2-EGFP-LYAR/RPL31克隆胚胎在囊胚发育率方面没有显著差异,但是pIRES2-EGFP-LYAR/RPL31克隆胚在囊胚发育率方面明显低于体细胞克隆对照组及pIRES2-EGFP-LYAR/RPL31克隆胚胎,有显著差异(P<0.05)；在囊胚细胞数方面,pGCsi-LYAR/RPL31克隆胚的囊胚细胞数明显低于体细胞克隆组及pIRES2-EGFP-LYAR/RPL31克隆胚胎,具有显著差异(P<0.05)。GeXP多重基因表达分析结果显示囊胚中LYAR、RPL31两个基因的低表达不同程度降低了调控细胞生长的基因TP53、GATA2、CDX2、DNMT3A和干细胞特性基因OCT4、NANOG的表达,而上调了细胞凋亡相关基因BAX、BCL-2的表达。