【摘 要】
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本试验用基因克隆、测序、.双荧光素酶报告系统和干扰RNA等方法,研究了猪MITF-M基因的转录调控区域序列及其转录活性与功能,得到了如下结果：1、从藏猪基因组中调取了含有MITF
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本试验用基因克隆、测序、.双荧光素酶报告系统和干扰RNA等方法,研究了猪MITF-M基因的转录调控区域序列及其转录活性与功能,得到了如下结果：1、从藏猪基因组中调取了含有MITF基因的scarffords,将其作为参考序列设计了3对相互重叠的引物,通过PCR克隆测序,首次获得猪MITF-M转录调控区约7.8kb的序列。2、根据测序得到的MITF-M调控区序列设计引物,利用“巢式”PCR克隆转录调控区域片段,通过酶切、连接、转化,成功构建并验证了猪MITF-M基因转录调控区域的10段5’端缺失报告基因载体:PGL3-1140、PGL3-1397、PGL3-2470、PGL3-3487、 PGL3-3753、PGL3-5201、PGL3-5429、PGL3-6036、PGL3-6274、PGL3-6416。3、将所构建的10个载体转染到B16细胞,48小时后,利用双荧光素报告系统检测10个载体的荧光素酶活性,确定了MITF-M转录调控区存在两个重要核心区域,分别位于-2470-3487 bp的负调控区和-5429～-6036 bp的正调控区。4、利用转录因子预测软件JASPAR和干扰RNA法,发现并验证了-2470～-3487 bp区域的KLF4结合位点及KLF4对MITF-M的转录活性的双重调控作用。该研究结果为进一步研究猪MITF基因的表达机制奠定了基础,对深入研究猪MITF-M转录调控区域的活性和表达调控机理具有重要意义。
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