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第1章引言肿瘤内一小部分细胞具有自我更新、多潜能分化等干细胞特性,能产生异质性肿瘤细胞并启动肿瘤的发生,这一部分细胞被称为肿瘤干细胞(CSCs)。CSCs的起源及维持因素不是很清楚。有研究表明,缺氧和HIFs可诱导肿瘤细胞获得CSCs特性,但分子机制不明。Notch信号通路为细胞间信息传递的重要方式之一。有研究发现,Notch信号通路在肺CSCs特性的诱导或维持中发挥重要作用,但Notch的哪些成分在其中发挥作用目前还不清楚。本研究假设缺氧通过HIF-1α增强Notch1信号通路诱导肿瘤细胞获得CSCs特性。采用慢病毒载体及转染技术,构建HIF-1α和N1ICD稳定表达肺腺癌细胞株。q PCR探讨缺氧对肺腺癌细胞干细胞标志物表达的影响以及Notch1信号通路在其中的作用。q PCR进一步探讨HIF-1α和N1ICD对肺腺癌细胞干细胞标志物表达的影响。运用构建好的HIF-1α和N1ICD稳定表达肺腺癌细胞株,通过药物敏感实验、成球实验以及体内裸鼠成瘤实验来探讨HIF-1α/N1ICD对肺腺癌细胞CSCs特性的影响,试图为理解NSCLC的生物学行为提供理论依据。第2章HIF-1α稳定表达肺腺癌细胞株构建目的:利用慢病毒载体构建HIF-1α稳定表达肺腺癌细胞株。方法:以人HIF-1α基因编码序列为模板,设计并合成引物。PCR法扩增HIF-1α基因,用以构建慢病毒重组质粒HBLV-HIF-1α-RFP-Puro。PCR和基因测序鉴定重组质粒。高纯度无内毒素抽提慢病毒重组质粒和辅助质粒,共转染293T细胞包装慢病毒(LV-HIF-1α)。同时构建慢病毒空载载体(LV-RFP-Puro)作为对照。采用稀释计数法测定病毒滴度。制备好的LV-HIF-1α和LV-RFP-Puro转染A549细胞,嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株。荧光显微镜观察筛选效果,Western blotting进一步验证。MTT法和流式细胞仪检测细胞活力及凋亡。结果:重组慢病毒质粒HBLV-HIF-1α-RFP-Puro经PCR、基因测序鉴定构建成功。经包装、浓缩后获得高滴度LV-HIF-1α和LV-RFP-Puro。LV-HIF-1α和LV-RFP-Puro转染A549细胞后经药物反复筛选,荧光显微镜下观察到70-80%的细胞带有红色荧光。Western blotting结果显示A549-HIF-1α组HIF-1α、N1ICD、Hes1和Hey1蛋白的表达水平明显高于A549-RFP-Puro组。HIF-1α稳定表达可促进肺腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。结论:HIF-1α稳定表达肺腺癌细胞株构建成功。HIF-1α稳定表达促进肺腺细胞增殖并诱导细胞凋亡。第3章N1ICD稳定表达肺腺癌细胞株构建目的:利用慢病毒载体构建N1ICD稳定表达肺腺癌细胞株。方法:以人N1ICD基因编码序列为模板,设计并合成引物。PCR扩增N1ICD基因,用以构建慢病毒重组质粒p HBLV-N1ICD-Zs Green-Puro。PCR和基因测序鉴定重组质粒。重组质粒和辅助质粒共转染293T细胞包装慢病毒(LV-N1ICD)。同时构建慢病毒空载载体(LV-Zs Green-Puro)。采用稀释计数法测定病毒滴度。制备好的LV-N1ICD和LV-Zs Green-Puro转染A549细胞,嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株。荧光显微镜观察转染效率,Western blotting检测N1ICD、Hes1、Hey1和HIF-1α的表达。MTT法和流式细胞仪检测细胞活力及凋亡。结果:PCR及基因测序结果表明重组慢病毒质粒p HBLV-N1ICD-Zs GreenPuro构建成功。经包装、浓缩后获得高滴度LV-N1ICD和LV-Zs Green-Puro。慢病毒载体转染A549细胞后经药物反复筛选,荧光显微镜发现70~80%的细胞带有绿色荧光。Western blotting结果显示A549-N1ICD组N1ICD、Hes1、Hey1和HIF-1α的表达水平明显高于A549-Zs Green-Puro组。N1ICD稳定表达可促进A549细胞增殖。结论:N1ICD稳定表达肺腺癌细胞株构建成功。N1ICD稳定表达促进肺腺细胞增殖。第4章HIF-1α通过N1ICD诱导肺腺癌细胞获得肿瘤干细胞特性目的:探讨HIF-1α和N1ICD在缺氧诱导肺腺癌细胞肿瘤干细胞特性中的作用。方法:q PCR探讨缺氧对肺腺癌细胞干细胞标志物CD133、Oct4、c-Myc、ABCG2、ALDH1、KLF4和Sox2表达的影响以及Notch1信号通路在其中的作用。利用构建好的HIF-1α和N1ICD稳定表达肺腺癌细胞株,q PCR探讨HIF-1α和Notch1信号通路对肺腺癌细胞干细胞标志物表达的影响。CCK-8探讨HIF-1α和Notch1信号通路对肺腺癌细胞顺铂和多西他赛敏感性的影响,计算IC50。成球实验探讨HIF-1α和Notch1信号通路对肺腺癌细胞自我更新能力的影响。裸鼠成瘤实验探讨HIF-1α和Notch1信号通路对肺腺癌细胞体内成瘤能力的影响。结果:缺氧可诱导A549细胞CD133、Oct4、c-Myc、ABCG2、ALDH1和Sox2等干细胞标志物高表达,抑制Notch1信号通路后,干细胞标志物水平明显下降。HIF-1α和N1ICD稳定表达均可诱导A549细胞多重干细胞标志物高表达,抑制Notch1信号通路可明显抑制HIF-1α诱导的干细胞标志物的表达。HIF-1α和N1ICD稳定表达均可诱导A549细胞对顺铂和多西他赛耐药,抑制Notch1信号通路后,A549-HIF-1α细胞恢复了对顺铂和多西他赛的敏感性。A549-HIF-1α和A549-N1ICD组细胞成球数目均明显高于对照组,抑制Notch1信号通路可明显抑制HIF-1α诱导的肺腺癌细胞自我更新。A549-HIF-1α和A549-N1ICD组形成肿瘤的体积、重量均明显大于对照组。Notch抑制剂GSI可明显抑制A549-HIF-1α细胞裸鼠成瘤能力。结论:HIF-1α通过N1ICD诱导肺腺癌细胞获得肿瘤干细胞特性。